Thu mẫu máu cá và bảo quản:
Máu cá được thu 1 lần/tuần cùng với các chỉ tiêu môi trường nói trên. Mẫu máu được thu ngẫu nhiên 3 con/bể, khối lượng và chiều dài của cá được xác định trước khi tiến hành thu mẫu máu. Dùng kim tiêm 1 mL lấy 0,4-0,6 mL máu ở động mạch đuôi cá sau đó cho máu vào ependorf trữ lạnh trong suốt thời gian phân tích.
3.4.2.1 Đếm hồng cầu
26
Hồng cầu được đếm bằng phương pháp pha loãng mẫu máu 200 lần với dung dịch Natt-herrick. Tiến hành đếm hồng cầu bằng cách dùng pipet hút 5 µL máu cho vào ependorf có chứa 995 µL dung dịch Natt-herrick, sau đó trộn đều, dùng pipet cho dung dịch vào buồng đếm Neubauer. Đếm số lượng hồng cầu có trong 5 ô lớn ở vật kính 40 (mỗi ô lớn có chứa 16 ô nhỏ) trong tổng số 25 ô có trong buồng đếm. Số lượng hồng cầu được tính như sau:
H (tb/mm3) = C x 200/80 x 0,00025 x 106
Trong đó:
C: là tổng số lượng hồng cầu đếm được trong 5 vùng đếm. 200: là số lần pha loãng.
0,00025: thể tích mỗi ô đếm.
3.4.2.2 Đếm bạch cầu
Phương pháp đếm bạch cầu:
Đếm số lượng hồng cầu và bạch cầu trên tổng số 1.500 tế bào của mẫu nhuộm theo hình zíc zắc bằng kính hiển vi ở vật kính 100x theo phương pháp của Supranee (1991). Công thức tính số lượng bạch cầu như sau:
TBC (tb/mm3) = (số BC trong 1.500 tế bào x R)/(số HC trong 1.500 tế
bào)
Trong đó:
R: mật độ tế bào hồng cầu trong mẫu máu (tế bào/mm3)
3.4.2.3 Đo hemoglobin
Phương pháp đo hemoglobin:
27
Pha loãng 10 µL máu cá với 2,5 mL thuốc thử Drabkin trong cuvet. Thuốc thử sẽ chuyển huyết sắc tố thành chất Cyanomethemoglobin có màu vàng.
Dùng máy so màu quang phổ đo mức độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 540 nm, nhiệt độ 20-25o
C. Số lượng huyết sắc tố (Hb) được tính theo công thức sau:
Số lượng huyết sắc tố (A) (mol/L) = (0,019 + 37,74 x a) x 0,621
Trong đó: a là mức độ hấp thụ ánh sáng.
Số lượng huyết sắc tố g/100 mL = A x 1,6125 3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu được về môi trường và các chỉ tiêu huyết học được tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel, so sánh thống kê bằng phương pháp ANOVA trong phần mềm SPSS 16.0 có mức ý nghĩa p = 0,05.
28
Chương 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Biến động các yếu tố môi trường khi cho cá ăn thức ăn có bổ sung tinh dầu tinh dầu
4.1.1 Nhiệt độ
Trong suốt thời gian thí nghiệm nhiệt độ dao động trong khoảng 24,3 - 29,5oC. Ở nghiệm thức ĐC (0%) và nghiệm thức 0,02% nhiệt độ trung bình là 25,9 - 27,5; ở nghiêm thức 0,04% và 0,06% nhiệt độ tương ứng với 25,9-27,3; 25,9 - 27,4 (Hình 5). Sự chênh lệch nhiệt độ giữa các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05). Do thí nghiệm bổ sung tinh dầu được thực hiện trong khoảng tháng 12 đến tháng 1 (dương lịch) nên nhiệt độ xuống thấp (24,3 – 29,5oC). Theo Nguyễn Quang Vinh (2009) nhiệt độ trong các bể nuôi cá tra (26 g/con) là 26,3oC - 30,3oC do thí nghiệm này được thực hiện từ tháng 4 – 6/2009 cho thấy nhiệt độ ở thí nghiệm bổ sung tinh dầu thấp hơn. Ngoài ra, nhiệt độ đo được ở các thủy vực nuôi cá tra dao động từ 26,79oC - 32,03oC (Nguyễn Hữu Lộc, 2009) cũng cao hơn nhiệt độ ở thí nghiệm có bổ sung tinh dầu. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của cá tra là 26-30oC (Nguyễn Chung, 2007, trích dẫn bởi Quách Chí Tâm, 2009). Nhìn chung, nhiệt độ thấp hơn khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá.
29
4.1.2 pH
pH suốt quá trình thí nghiệm dao động từ 6,8 - 7,9. Ở nghiệm thức ĐC pH khoảng 7,4 - 7,5; nghiệm thức 0,02% và 0,04% pH từ 7,4 - 7,5 và nghiệm thức 0,06% pH từ 7,3 - 7,4. pH khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (p>0,05). pH ở thí nghiệm có bổ sung tinh dầu cũng phù hợp với pH từ 6,9 – 7,7 trong thí nghiệm ảnh hưởng của oxi hòa tan lên tăng trưởng của cá tra giống (Nguyễn Trần Trọng Thắng, 2009) và phù hợp với pH từ 7,8 – 8,3 trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Florfenicol (FFC) lên tăng trưởng và một số thay đổi huyết học của cá tra giống (Nguyễn Quang Vinh, 2009). Ngoài ra, pH ở thí nghiệm bổ sung tinh dầu cũng phù hợp với pH từ 6,1 – 8,8 trong nghiên cứu sự biến đổi chất lượng nước trong hệ thống nuôi cá tra thâm ở các quy mô khác nhau tại tất cả các điểm qua 3 đợt thu mẫu (Nguyễn Hữu Lộc, 2009). Nhìn chung pH trong suốt quá trình thí nghiệm khá ổn định, nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá (Hình 6).
Hình 6: Biến động pH của các nghiệm thức
4.1.3 Oxy hòa tan (DO)
Trong suốt quá trình thí nghiệm oxy trong khoảng 5,1 - 13,7 mg/L có xu hướng giảm dần về cuối chu kỳ nuôi ở các nghiệm thức. Hàm lượng DO trung
30
bình ở 4 nghiệm thức là 5,7–8,6; 5,1–13,7; 5,2–10,0; 5,4–10,6 mg/L tương ứng với các nghiệm thức 0%; 0,02%; 0,04%; 0,06%. Hàm lượng DO giữa các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05). Hàm lượng DO trong nước thích hợp cho cá nuôi là > 5mg/L (Quy chuẩn quốc gia về chất lượng nước mặt bảo vệ đời sống thủy sinh vật, 2011). Khi nghiên cứu hàm lượng oxy hòa tan trong các ao cá khỏe và cá bệnh tại An Giang, Huỳnh Trường Giang và ctv (2008) cho biết hàm lượng DO rất biến động, trong các ao cá khỏe dao động từ 0,44 - 15,9 mg/L và trong các ao cá bệnh là 0,7 - 12,1 mg/L. Nhóm nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng sự khác biệt oxy giữa ao cá bệnh và cá khỏe là không có ý nghĩa (p> 0,05). Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Dương Thuý Yên (2003) cho thấy cá tra có khả năng sống được trong môi trường có hàm lượng oxy < 2 mg/L. Điều này cho thấy hàm lượng oxy hòa tan trong suốt quá trình thí nghiệm phù hợp với sự phát triển của cá (Hình 7).
Hình 7: Biến động oxy của các nghiệm thức
4.1.4 Tổng đạm amoni-TAN (NH3 + NH4+)
Hàm lượng TAN trong quá trình thí nghiệm là 0,68±0,75 mg/L, biến động nhiều và giảm dần về cuối vụ nuôi. Ở nghiệm thức 0%; 0,02%; 0,04%; 0,06% hàm lượng TAN tương ứng là 1,46±0,99; 0,41±0,16; 1,54±0,97; 1,09±0,69 mg/L. Hàm lượng TAN ở các nghiệm thức trong quá trình thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Hình 8). Nghiệm thức
31
0,02% là nghiệm thức thích hợp nhất cho sự phát triển của cá vì hàm lượng TAN ở nghiệm thức này thấp nhất (0,41±0,16 mg/L) so với các nghiệm thức còn lại. TAN trong nghiên cứu của Nguyễn Hữu Lộc (2009) qua các đợt thu mẫu dao động rất lớn từ 0,03 - 7,44 cao hơn TAN ở thí nghiệm bổ sung tinh dầu. Theo Boyd (1998), hàm lượng TAN thích hợp cho ao nuôi thủy sản là 0,2 - 2 mg/L. Theo Quy chuẩn quốc gia về chất lượng nước mặt bảo vệ đời sống thủy sinh vật (2011) nồng độ NH3 cho phép trong nước nuôi thủy sản nước ngọt là 1mg/L. Hàm lượng NH3 cao nhất từ hàm lượng TAN đã đo, được tính dựa vào nhiệt độ và pH. Nồng độ NH3 cao nhất tính từ hàm lượng TAN trung bình cao nhất là 5,49 g/mL (Robinette, 1983 trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Lộc, 2009). Ngoài ra, nhiệt độ ở thí nghiệm bổ sung tinh dầu trong khoảng 24,3– 29,5oC nên hàm lượng TAN không ảnh hưởng đến sự phát riển của cá vì nồng độ của NH3 tăng khi pH và nhiệt độ tăng (Trương Quốc Phú, 2003). Mặt khác, TAN cao vào ngày đầu của thí nghiệm và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở nghiệm thức 0% và 0,04% và 0,06% là do cá bị stress sau đó chết nên môi trường nước ở các nghiệm thức này bị ô nhiễm. Nhưng trong quá trình thí nghiệm có thay nước nên hàm lượng TAN sau 7 ngày có xu hướng giảm dần. Nhìn chung, trong suốt quá trình thí nghiệm hàm lượng TAN khá biến động nhưng vẫn phù hợp với sự phát triển của cá.
32
4.1.5 Nitrite (N-NO2-)
Qua kết quả phân tích cho thấy hàm lượng N-NO2- trung bình trong quá trình thí nghiệm là 1,06±1 mg/L. Hàm lượng N-NO2- cao nhất sau 7 ngày ương ở tất cả các nghiệm thức và giảm dần về cuối vụ nuôi. Hàm lượng N- NO2- trung bình của các nghiệm thức 0%; 0,02%; 0,04%; 0,06% lần lượt là 1,08±1,22; 1,10±128; 0,97±0,74; 1,10±1 mg/L. Hàm lượng N-NO2- ở các nghiệm thức trong suốt thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Hình 9). Hàm lượng N-NO2- cao trong những ngày đầu thí nghiệm là do cá chết và thức ăn thừa bị phân hủy. Theo Trương Quốc Phú (2003) hàm lượng N-NO2- thích hợp cho cá là < 0,1 mg/L và biện pháp duy trì hàm lượng N-NO2- thích hợp tương tự như duy trì TAN vì vậy trong suốt quá trình thí nghiệm nhiệt độ thấp và thí nghiệm được thay nước thường xuyên cho nên hàm lượng N-NO2- có cao tuy nhiên không ảnh hưởng đến sự phát triển của cá.
Hình 9: Biến động N-NO2 -
của các nghiệm thức
4.1.6 Lân hòa tan (P-PO43-)
Hàm lượng lân hòa tan trung bình ở các nghiệm thức tương đối cao và có xu hướng tăng, với giá trị trung bình là 17±0,35 mg/L. Ở nghiệm thức 0% hàm lượng P-PO43-
là 1,43±0,38 mg/L cao nhất so với các nghiệm thức còn lại. Hàm lượng P-PO43- ở các nghiệm thức 0,02%; 0,04%; 0,06% lần lượt là 1,08±0,3; 1,15±0,21; 1,02±0,38 mg/L (Hình 10). Hàm lượng lân hòa tan ở các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05). Đối với ao nuôi thủy sản
33
lân không độc nhưng nếu hàm lượng lân hòa tan cao > 0,2 mg/L thì tảo sẽ nở hoa làm biến động các yếu tố môi trường (Trương Quốc Phú, 2003). Ngoài ra, sự phân hủy của thức ăn thừa và phân động vật là nguồn cung cấp liên tục lượng phốt – pho cho nước (Boyd, 1998). Ở thí nghiệm này ngoài việc thức ăn thừa, chất thải của cá thì việc phân hủy xác cá chết cũng góp phần làm tăng hàm lượng lân hòa tan trong nước. Nhưng với việc thay nước thường xuyên thì không có hiện tượng tảo nở hoa làm biến đổi các yếu tố môi trưởng bể nuôi.
Hình 10: Biến động P-PO4 3-
của các nghiệm thức
4.2 Ảnh hưởng của thức ăn có bổ sung tinh dầu lên các chỉ tiêu huyết học học
4.2.1 Mật độ hồng cầu và bạch cầu qua từng đợt thu mẫu
a. Đợt 1 (ngày 18/12/2012)
Sau bố trí thí nghiệm 1 ngày chưa cho ăn thức ăn bổ sung tinh dầu cá chỉ ăn thức ăn CP 30% Protein; béo tối thiểu 5%. Mật độ hồng cầu dao động từ 2,07×106 - 2,04×106 tb/mm3. Cao nhất ở nghiệm thức ĐC (2,07×106 tb/mm3), thấp nhất là nghiệm thức 0,06% (2,04×106 tb/mm3) khác biệt không ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong cùng một đợt (p>0,05) (Hình 11).
Mật độ bạch cầu trong khoảng 0,87×105 - 1,69×105 tb/mm3, cao nhất ở nghiệm thức 0,02% (1,69×105 tb/mm3) và thấp nhất ở nghiệm thức 0,04% (0,87×105 tb/mm3) kế đến là nghiệm thức 0,06% (1,33±0,47 tb/mm3) và nghiệm thức ĐC (1,24±0,69 tb/mm3). Mật độ bạch cầu ở các nghiệm thức 0,04%; 0,06% và ĐC khác biệt không ý nghĩa (p>0,05), nhưng khác biệt có ý
34
nghĩa thống kê giữa nghiệm thức 0,04% so với nghiệm thức 0,02% và 0,06% (p<0,05) (Hình 11).
Hình 11: Mật độ hồng cầu và bạch cầu đợt 1
b. Đợt 2 (ngày 28/12/2012)
Sau 7 ngày cho ăn thức ăn bổ sung tinh dầu, mật độ hồng cầu dao động từ 1,63×106 tb/mm3 - 2,16×106 tb/mm3 tương ứng với nghiệm thức 0,04% và 0,02% tiếp theo là nghiệm thức 0,06% (1,70×106 tb/mm3) và nghiệm thức ĐC (2,12×106 tb/mm3) các nghiệm thức ở lần thu này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Trong cùng đợt thu, nghiệm thức ĐC và 0,02% mật độ hồng cầu có xu hướng tăng so với đợt 1 nhưng không nhiều (<10%) khác biệt không ý nghĩa thống kê (p>0,05), ở nghiệm thức 0,04% và 0,06% mật độ hồng cầu có xu hướng giảm tương ứng với 20,87% và 16,26% (p>0,05) cũng không khác biệt so với lần thu đầu (Hình 12).
Ở lần thu mẫu thứ 2 mật độ bạch cầu ở 4 nghiệm thức ĐC; 0,02% ; 0,04%; 0,06% lần lượt là 1,04×105; 0,82×105; 0,78×105; 0,49×105 tb/mm3. Mật độ bạch cầu giảm tỷ lệ nghịch với nồng độ tinh dầu ở các nghiệm thức trong cùng đợt và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa nghiệm thức ĐC và nghiệm thức 0,06%. Ngoài ra, ở lần thu này mật độ bạch cầu có xu hướng giảm ở tất cả 4 nghiệm thức so với lần thu trước. Ở nghiệm thức ĐC và 0,04% giảm khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với lần thu thứ nhất. Nhưng ở nghiệm thức 0,02% và 0,06% mật độ bạch cầu giảm lần lượt là
35
51,48% (từ 1,69×105 giảm còn 0,82×105 tb/mm3) và 64,49% (từ 1,38×105 giảm còn 0,49×105 tb/mm3) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đợt 1. (Hình 12).
Hình 12: Mật độ hồng cầu và bạch cầu đợt 2
c. Đợt 3 (ngày 4/1/2013)
Mật độ hồng cầu sau 14 ngày thí nghiệm là 2,23×106; 2,34×106; 2,28×106 và 1,73×106 tb/mm3 ứng với 4 nghiệm thức ĐC; 0,02%; 0,04%; 0,06% khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức trong cùng một đợt (p>0,05). So với lần thu mẫu thứ 2 mật độ hồng cầu ở lần thu này có sự tăng lên ở tất cả các nghiệm thức sau 14 ngày thí nghiệm cho ăn thức ăn có bổ sung tinh dầu, tăng nhiều nhất ở nghiệm thức 0,04% từ 1,36×106 tb/mm3 lên 2,28×106 tb/mm3 (39,88%) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và các nghiệm thức còn lại tăng tương ứng là 5,19% (ĐC); 8,33% (0,02%) và ít nhất ở nghiệm thức 0,06 (1,76%) khác biệt không ý nghĩa (p>0,05) so với mật độ hồng cầu ở đợt 2 (Hình 13).
Mật độ bạch cầu ở đợt thu này lần lượt là 0,84×105 tb/mm3 (ĐC); 0,76×105 tb/mm3 (0,02%); 1,35×105 tb/mm3 (0,04%) và 0,79×105 tb/mm3 (0,06%). Qua 14 ngày thí nghiệm mật độ tế bào bạch cầu cao nhất ở nghiệm thức 0,04% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại trong
36
cùng một đợt (p<0,05). So với đợt thu thứ 2 mật độ bạch cầu có xu hướng giảm ở nghiệm thức ĐC (20% ) và 0,02% (7,32%) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Ngược lại, ở nghiệm thức 0,04% và 0,06% mật độ bạch cầu có xu hướng tăng tương ứng là 73,08% và 61,22% khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đợt thu trước (p>0,05). (Hình 13).
Hình 13: Mật độ hồng cầu và bạch cầu đợt 3
d. Đợt 4 (ngày 11/1/2013)
Ở lần thu này mật độ hồng cầu trong các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05); ở nghiệm thức ĐC mật độ hồng cầu là 1,36×106 tb/mm3; nghiệm thức 0,02% là 1,88×106 tb/mm3; nghiệm thức 0,04% là 1,37×106 tb/mm3 và nghiệm thức 0,06% là 1,49×106 tb/mm3. Mật độ hồng cầu đều giảm ở tất cả các nghiệm thức so với đợt thu mẫu thứ 3. Ở nghiệm thức ĐC và 0,06% mật độ hồng cầu giảm nhưng không khác biệt (p>0,05) so với đợt 3. Ngược lại, mật độ hồng cầu giảm nhiều nhất ở nghiệm thức 0,04% từ 2,28×106 tb/mm3 xuống 1,37×106 tb/mm3 (39,91%), và ở nghiệm thức 0,02% mật độ hồng cầu giảm từ 2,34×106 tb/mm3 xuống 1,88×106 tb/mm3 (19,66%) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Hình 14).
Trong đợt thu này mật độ bạch cầu ứng với các nghiệm thức như sau: nghiệm thức ĐC (0,73×105 tb/mm3); nghiệm thức 0,02% (0,56×105 tb/mm3); nghiệm thức 0,04% (1,10×105 tb/mm3) và nghiệm thức 0,06% (0,66×105
37
tb/mm3) khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức trong cùng một đợt (p>0,05). Ở đợt thu này mật độ bạch cầu ở tất cả các nghiệm thức đều giảm tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với đợt thu thứ 3 (Hình 14).
Hình 14: Mật độ hồng cầu và bạch cầu đợt 4
e. Đợt 5 (ngày 18/1/2013)
Mật độ hồng cầu ứng với các nghiệm thức ĐC; 0,02%; 0,04%; 0,06% là 1,78×106; 2,11×106; 1,67×106 và 1,21×106 tb/mm3 khác biệt không ý nghĩa (p>0,05) lần lượt giữa nghiệm thức ĐC và 0,02%; nghiệm thức 0,04% và 0,06%, nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa nghiệm thức 0,06% với nghiệm thức ĐC và nghiệm thức 0,02% trong cùng đợt thu mẫu. Mật độ hồng cầu đều tăng ở 3 nghiệm thức: ĐC; 0,02% và 0,04% so với đợt thu mẫu thứ 4. Ở nghiệm thức ĐC và 0,04% tăng tương ứng là 14,72% và 21,90%