2.2.4.1. Cơ sở lý thuyết
Trong phân tích hóa thực vật có rất nhiều phương pháp phân tích. Sắc ký cột (SKC) là một trong những phương pháp quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên.
SKC là loại sắc ký trong đó pha tĩnh được nhồi trong một cột bằng thủy tinh hay bằng thép không gỉ. Pha tĩnh (chất hấp phụ) thường được sử dụng là silica gel. Pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệ dung môi dựa vào SKLM. Pha động di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới ảnh hưởng của trọng lực. Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách tùy theo ái lực với pha tĩnh và pha động để lấy ra được trước hoặc sau.
18
Hình 2.9: Hệ thống SKC cổ điển Cách tiến hành SKC gồm 5 bước:
Chuẩn bị cột.
Nhồi cột (cho chất hấp phụ vào cột).
Đưa chất phân tích vào cột.
Triển khai cột.
Hứng và kiểm tra các phân đoạn.
Trong SKC với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau.Muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25 – 50 lần trọng lượng của mẫu và chiều cao trong cột sắc ký cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1).
Bảng 2.4: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần
Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột
Hydrocarbon Alken Ether Hydrocarbon R-H Hợp chất thơm Ketone Aldehyde Ester Alcohol Amine Carboxylic acid
19
2.2.4.2 Dung môi giải ly
Có hai kiểu giải ly:
Giải ly theo kiểu sử dụng dung môi đơn nồng độ.
Giải ly với dung môi có tính phân cực tăng dần (tăng dần theo kiểu bậc thang và tăng dần tuyến tính).
Vận tốc dung môi giải ly không quá nhanh cũng không được quá chậm, thường ở khoảng 5 – 50 giọt/phút hoặc 1 – 2 cm/phút.
Giải ly có nồng độ tăng dần theo kiểu bậc thang:
Đôi khi, việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn. Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có độ phân cực tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác ra khỏi cột.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm: Thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực cao hơn vào dung môi cũ đang sử dụng. Thí dụ: Giải ly với hệ hexane, muốn chuyển sang benzene, sẽ pha benzene vào hexane theo tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 50% và 100% benzene. Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thụ dẫn đến tách chất không tốt.
2.2.4.3 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng SKC có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu khác nhau, đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột. Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau, thường là 50 mL. Dung dịch trong những lọ nào có kết quả SKLM giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém, các phân đoạn này sẽ cho các cao của phân đoạn đó.
20