2.3.1 Đại cương về hợp chất glycoside
Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận của cây: lá, vỏ, hạt… Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị đắng.
Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của emzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycoside bị thủy phân thành aglycon và phần đường.Phần đường của glycoside: phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác.Phần aglycon của glycoside: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol, benzyl nitrile, thiocarbamate… Một số hợp chất tiêu biểu được trình bày trong Hình 2.8.
Osmundalacton Ptaquiloside Isatan B (Osmunda japonica) (Hypolepis punctaca) (Isatis tinctoria) Lacton glucoside Sesquiterpene glucoside Alkaloid glycoside
Niazinin Rutin
(Moringa oleifera Lam.) (Hedyotis nigricans)
Thiocarbamate glycoside Flavon glycoside
21
2.3.2 Phương pháp chiết tách các glycoside ra khỏi cây
Cấu trúc hóa học của glycoside rất đa dạng nên tính phân cực của mỗi phân tử thay đổi tùy theo cấu trúc của aglycon và số phân tử đường gắn vào aglycon, vì thế không thể có một phương pháp chung nào cho tất cả glycoside, phải xét từng trường hợp cụ thể.
Nói chung các glycoside có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong petroleum ether, hexane, benzene, nhưng tan được trong chloroform, diethyl ether (các monoglycoside), tan tốt trong alcohol, nước. Người ta thường chiết glycoside bằng nước nóng, ethanol, methanol hoặc hỗn hợp alcohol – nước (50 – 90%).
Trước tiên bột cây được loại béo bằng hexane hoặc petroleum ether, bột cây còn lại được chiết tiếp bằng alcohol 50 – 100% (ethanol, methanol). Dung dịch alcohol được thêm một ít nước và được loại tạp bằng dung dịch acetate chì 20%. Cũng có thể loại tạp bằng Pb(OH)2, Al(OH)3, Fe(OH)3... Lọc bỏ tủa. Dung dịch nước trong này được cho thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4 để tủa acetate chì. Lọc lấy phần nước trong. Dung dịch này được tận chiết lỏng – lỏng bằng chloroform, ethyl acetate và butanol. Các dung dịch chiết này được làm khan nước bằng Na2SO4 hoặc MgSO4 khan, rồi đuổi dung môi sẽ thu được cao. Cao Chloroform chứa monoglycoside (aglycon nối với một phân tử đường), các cao ethyl acetate, butanol chứa polyglycoside (hợp chất gồm aglycon nối với nhiều phân tử đường, có thể các phân tử đường nối với nhau thành chuỗi đường hoặc có thể aglycon nối với nhiều monosachride ở những vị trí khác nhau).
22
Hình 2.11: Quy trình tách chiết glycoside ra khỏi cây Dung dịch nước Trầm hiện PbSO4
Dung dịch nước
Dung dịch nước
Dung dịch
nước Dung dịch butanol
Polyglycoside
Dung dịch ethyl acetate Dung dịch chloroform
Polyglycoside Bột cây
Petroleum ether Dung dịch nước alcohol
Dung dịch nước Trầm hiện
Tận chiết với petroleum ether để loại béo
Tận chiết với hỗn hợp ethanol hoặc methanol-nước
Dung dịch nước acetate chì 2 -5%
Lọc, rửa tủa với nước cất
Dung dịch Na2SO4 bão hòa
Lọc, rửa tủa với nước cất
Tận chiết lỏng – lỏng với chloroform
Tận chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate
Tận chiết lỏng – lỏng với butanol
Làm khan nước
Thu hồi dung môi
Làm khan nước
Thu hồi dung môi
Làm khan nước
Thu hồi dung môi
Monoglycosid e
23
Chương 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện sử dụng trong nghiên cứu
3.1.1 Dụng cụ
Tủ sấy: dùng để sấy nguyện liệu và các dụng cụ bằng thủy tinh.
Máy cô quay: dùng để thu hồi dung môi và đuổi dung môi ra khỏi mẫu để có thể làm khô mẫu nhanh hơn.
Cột sắc ký có đường kính (d), chiều dài (l) như sau:
d = 5,0 cm, l = 80 cm
d = 3,0 cm, l = 55 cm
d = 2,0 cm, l = 40 cm
d = 1,0 cm, l = 45 cm
Một số dụng cụ khác: lọ bi, chai đựng dung dịch, các loại becher, bình chiết, đũa thủy tinh, bếp điện, cân điện tử, đèn cồn...
3.1.2 Hóa chất
Silica gel Scharlau 60 (0,04 – 0,06 mm) và bản mỏng tráng sẵn (Merck, Đức).
Dung môi: petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol, butanol, acetone.
Na2SO4 được dùng làm khan dung môi.
Sulfuric acid, vanillin dùng để pha thuốc thử hiện hình. Nước cất và một số hóa chất khác.
3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp chiết tách 3.2.1 Phương pháp chiết tách
Cây cỏ sau khi thu hái, được xử lý và rửa sạch sau đó ngâm với methanol. Cô quay dịch chiết thu được cao methanol tổng.
Từ cao methanol tổng ban đầu, sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, butanol, cô quay thu hồi dung môi ta được các cao petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, butanol.
24
3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ
Để phân lập hợp chất hữu cơ tinh khiết từ cây cỏ thì phương pháp chủ yếu dùng là sắc ký cột và dùng sắc ký lớp mỏng theo dõi song song với sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng sẽ giúp dự đoán hợp chất được tách đã tinh khiết chưa.
3.2.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (được đo bằng máy Bruker Avance với tần số 500 MHz cho phổ 1H và 125 MHz cho phổ 13C), HR-ESI-MS, HSQC, HMBC được đo tại trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
3.3 Thực nghiệm
3.3.1 Điều chế các loại cao 3.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu 3.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu
Mẫu thân non chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được thu hái tại khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ.
Nguyên liệu sau khi thu hái đem về được xử lý, loại bỏ những phần vàng úa, héo và phần sâu bệnh, rửa sạch thu được 25 kg nguyên liệu tươi. Sau đó tiếp tục phơi khô, sấy ở 60°C rồi xay nhuyễn được 2,5 kg bột khô.
25
Phần trăm độ ẩm của thân non chùm ngây là:
% độ ẩm thân non cây chùm ngây = 90% 25 100 ) 5 , 2 25 ( 3.3.1.2 Điều chế cao tổng
Bột cây được cho vào các túi vải nhỏ, sau đó, ngâm túi bột khô với lượng vừa đủ methanol trong một cái bình bằng thủy tinh có nắp đậy. Sau khoảng thời gian 24 giờ/mỗi lần ngâm thu lấy dịch chiết lọc qua giấy lọc và đem cô quay thu hồi dung môi. Cứ thế lặp lại quá trình này nhiều lần đến khi chiết kiệt các chất trong nguyên liệu bột cây. Lọc dung dịch và loại bỏ phần bã còn lại. Dịch lọc cô quay, thu hồi dung môi, cho sản phẩm là cao methanol tổng (130 g, màu xanh đen).
Hiệu suất điều chế cao methanol tổng: % 20 , 5 100 500 . 2 130 H
Hình 3.2: Ngâm dầm bột cây với methanol và cao methanol tổng
3.3.1.3 Điều chế các cao thành phần từ cao methanol tổng
Để điều chế các cao thành phần từ cao methanol tổng phương pháp được chọn để thực hiện là phương pháp chiết lỏng – lỏng.
a. Điều chế cao petroleum ether
Chuẩn bị bình lóng 500 mL, lấy mỗi lần khoảng 40g cao methanol, cho thêm nước vào với tỉ lệ thể tích cao:nước (1:1) cho vào bình lóng cùng dung môi petroleum ether (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên trong 15 phút, sau đó tách lấy lớp petroleum ether ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết
26
với petroleum ether cho đến khi màu của lớp petroleum ether phía trên nhạt dần và kiểm tra lại bằng SKLM. Chấm phần dịch chiết từ cao petroleum ether nếu không còn vết thì chứng tỏ chất đã được trích hoàn toàn vào dung môi petroleum ether, sau đó gom dịch chiết từ dung môi petroleum ether của các lần chiết lại, cô quay thu hồi dung môi thu được 60,6 g cao petroleum ether.
Hiệu suất trích cao petroleum ether từ cao methanol tổng: % 6 , 46 100 130 6 , 60 H
b. Điều chế cao chloroform
Lấy lớp nước phía dưới cho vào bình lóng cùng với dung môi chloroform (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp chloroform ở phía dưới, lấy lớp trên tiếp tục chiết với chloroform cho đến khi màu của lớp chloroform phía dưới nhạt dần. Kiểm tra lớp chloroform phía dưới bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi chloroform của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 8,7 g cao chloroform.
Hiệu suất trích cao chloroform từ cao methanol tổng: % 7 , 6 100 130 7 , 8 H
c. Điều chế cao ethyl acetate
Tương tự lấy lớp nước phía trên cho vào bình lóng cùng với dung môi ethyl acetate (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp ethyl acetate ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết với ethyl acetate cho đến khi màu của lớp ethyl acetate phía trên nhạt dần. Kiểm tra lớp ethyl acetate phía trên bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi ethyl acetate của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 5,41 g cao ethyl acetate.
Hiệu suất trích cao ethyl acetate từ cao methanol tổng: % 16 , 4 100 130 41 , 5 H
d. Điều chế cao butanol
Tiếp tục lấy lớp nước phía dưới cho vào bình lóng cùng với dung môi butanol (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau
27
đó tách lấy lớp butanol ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết với butanol cho đến khi màu của lớp butanol phía trên nhạt dần. Kiểm tra lớp butanol phía trên bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi butanol của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 4,82 g cao butanol.
Khi cô quay dịch chiết từ dung môi butanol để có được cao butanol cho thêm dung môi methanol theo tỷ lệ butanol:methanol (1:1). Nếu muốn lấy lại dung môi butanol thêm nước vào, dung môi butanol sẽ nổi lên, thu lấy dung môi butanol.
Hiệu suất trích cao butanol từ cao methanol tổng: % 71 , 3 100 130 82 , 4 H
3.3.2 Khảo sát cao chloroform
3.3.2.1 Khảo sát lớp mỏng cao chloroform
SKLM cao chloroform ban đầu với các hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng khi khảo sát với hệ dung môi chloroform:methanol (8:2), bản mỏng cho nhiều vết có màu khác nhau và cách nhau tương đối xa. Từ đó có thể thấy rằng các chất có trong cao chloroform này có tính phân cực khác nhau, tiếp tục khảo sát mong rằng sẽ cô lập được chất chứa trong cao chloroform.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.3: SKLM cao chloroform
28
3.3.2.2 Phân tích SKC cao chloroform a. SKC cao chloroform
SKC cao chloroform (8,70 g), sử dụng silica gel 60 Scharlau khối lượng silica gel sử dụng là 200 g, cột có đường kính 3 cm, dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE 100% đến Me. Dùng các lọ bi có thể tích 100 mL để hứng dung dịch sau giải ly và theo dõi quá trình SKC bằng SKLM.
Hình 3.4: SKC cao chloroform
Tập trung các lọ cho kết quả SKLM giống nhau, cô quay đuổi dung môi thu được 10 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát cao chloroform
Ký hiệu Dung môi giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g) Nhận xét trên SKLM C1 PE 100% 0,101 Vết tạp, mờ
C2 PE:Ea (9:1) 1,564 3 vết nằm sát nhau, còn dơ nhiều
C3 PE:Ea (8:2) 2,126 1 vết chính, tròn rõ, màu xanh có viền màu hồng, trên đầu còn nhiều vết dơ
C4 Ea:PE (1:1) 0,782 Vệt kéo dài, không có vết chính C5 PE:Ea (3:7) 1,189 1 vết màu vàng nâu, không rõ
ràng, còn dơ nhiều
C6 Ea 100% 1,209 1 vết màu vàng, tròn, rõ, còn có thêm 2 vết dơ phía trên
C7 Ea:Me (9:1) 0,114 Vệt kéo dài, không có vết chính C8 Ea:Me (8:2) 0,185 Vệt kéo dài, không có vết chính C9 Ea:Me (7:3) 1,012 Vệt kéo dài, không có vết chính
29
Qua kết quả thu được từ SKC cao chloroform, nhận thấy ở phân đoạn C3 và C6 cho SKLM có vết chính cụ thể, có thể tiếp tục khảo sát. Tuy nhiên thấy ở phân đoạn C6 gồm 1 vết chính rõ nét, ít dơ và dễ tách hơn, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.
b. Xử lý phân đoạn C6
Tiến hành SKC phân đoạn C6 có khối lượng 1,209 g, lượng silica gel sử dụng là 50 g, cột có đường kính 2 cm dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (8:2) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 10 mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu được 6 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.4.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (9:1) Hình 3.5: SKLM và SKC phân đoạn C6
Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn C6
Ký hiệu Dung môi
giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g)
Nhận xét SKLM
C6A PE:Ea (8:2) 0 Không có vết
C6B PE:Ea (7:3) 0,125 Vết tạp, mờ, không rõ ràng C6C PE:Ea (1:1) 0,182 2 vết, mờ, 1 vết màu xanh, 1 vết
màu vàng mờ phía trên, còn dơ nhiều
C6D PE:Ea (3:7) 0,517 1 vết chính màu vàng, tròn, rõ ràng còn dơ đầu
C6E Ea 100% 0,176 Vệt kéo dài, không có vết chính
C6F Me 0,113 Vệt kéo dài, không có vết chính
Qua kết quả SKC phân đoạn C6 nhận thấy rằng ở phân đoạn C6D có 1 vết chính màu vàng tròn, rõ ràng, còn hơi dơ đầu, lượng nhiều, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.
30
c. Xử lý phân đoạn C6D
Tiến hành SKC phân đoạn C6D có khối lượng 0,517 g, sử dụng cột có đường kính 1 cm và 20 g silica gel. Dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (7:3) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần hứng là 5 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu chính 5 phân đoạn được trình bày như Bảng 3.5.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.9: SKLM và SKC phân đoạn C6D
Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn C6D
Ký hiệu Dung môi giải
ly cột Khối lượng các phân đoạn (mg)
Nhận xét SKLM
C6D.1 PE:Ea (7:3) 0 Không có vết
C6D.2 PE:Ea (65:35) 0 Không có vết
C6D.3 PE:Ea (6:4) 86 Vết tạp
C6D.5 PE:Ea (3:7) 37 Vết tròn, màu vàng, không còn dơ
C6D.6 Me Không có vết
Qua kết quả SKC phân đoạn C6D, phân đoạn C6D.5 có một 1 vết màu vàng đồng nhất, không còn dơ, khối lượng khoảng 37 mg và có Rf = 0,6 đối với hệ dung môi giải ly SKLM Ea + 1 giọt Me. Hợp chất cô lập được đặt tên là TNCN-C1 và tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ NMR.
31
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thực nghiệm
Qua quá trình khảo sát cao chloroform và một số phân đoạn của cao chloroform, đã phân lập được hợp chất TNCN-C1 và đã tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HR-ESI-MS, HSQC, HMBC.
Đặc trưng vật lý của hợp chất TNCN-C1
Nhiệt độ nóng chảy: 183°C – 184°C.
Tan tốt trong methanol.
Tinh thể màu trắng.
SKLM với hệ dung môi Ea + 1 giọt Me cho 1 vết màu vàng đồng nhất, có Rf = 0,6 (thuốc hiện hình Vanillin).
1. DC + 1 giọt Me 2. Chloroform 100% 3. Ea + 1 giọt Me (Thuốc hiện hình Vanilin) Hình 4.1: Tinh thể và SKLM hợp chất TNCN-C1 với ba hệ dung môi khác nhau
4.2 Biện luận cấu trúc hóa học của TNCN-C1
Khối phổ HR-ESI-MS (Phụ lục F) của hợp chất TNCN-C1 cho thấy mũi ion phân tử giả [M+ Na]+ có m/z = 344,1110, suy ra TNCN-C1 có khối lượng phân tử là 321,1212.
32
4.2.1 Một số thông tin nhận được từ phổ 1H-NMR của TNCN-C1 (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B) (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B)
Hợp chất TNCN-C1 có 17H (không tính H của các nhóm –OH, –COOH...)
Các tín hiệu của vùng từ trường trung bình, δ ppm = 6 – 8 cho thấy