Phương pháp nghiên cứu

Một phần của tài liệu phân lập chất từ cao chloroform của thân non chùm ngây (moringa oleifera lam.), họ chùm ngây (moringaceae) (Trang 36)

3.2.1 Phương pháp chiết tách

Cây cỏ sau khi thu hái, được xử lý và rửa sạch sau đó ngâm với methanol. Cô quay dịch chiết thu được cao methanol tổng.

Từ cao methanol tổng ban đầu, sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, butanol, cô quay thu hồi dung môi ta được các cao petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, butanol.

24

3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ

Để phân lập hợp chất hữu cơ tinh khiết từ cây cỏ thì phương pháp chủ yếu dùng là sắc ký cột và dùng sắc ký lớp mỏng theo dõi song song với sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng sẽ giúp dự đoán hợp chất được tách đã tinh khiết chưa.

3.2.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được

Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (được đo bằng máy Bruker Avance với tần số 500 MHz cho phổ 1H và 125 MHz cho phổ 13C), HR-ESI-MS, HSQC, HMBC được đo tại trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Điều chế các loại cao 3.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu 3.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Mẫu thân non chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được thu hái tại khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ.

Nguyên liệu sau khi thu hái đem về được xử lý, loại bỏ những phần vàng úa, héo và phần sâu bệnh, rửa sạch thu được 25 kg nguyên liệu tươi. Sau đó tiếp tục phơi khô, sấy ở 60°C rồi xay nhuyễn được 2,5 kg bột khô.

25

Phần trăm độ ẩm của thân non chùm ngây là:

% độ ẩm thân non cây chùm ngây = 90% 25 100 ) 5 , 2 25 (    3.3.1.2 Điều chế cao tổng

Bột cây được cho vào các túi vải nhỏ, sau đó, ngâm túi bột khô với lượng vừa đủ methanol trong một cái bình bằng thủy tinh có nắp đậy. Sau khoảng thời gian 24 giờ/mỗi lần ngâm thu lấy dịch chiết lọc qua giấy lọc và đem cô quay thu hồi dung môi. Cứ thế lặp lại quá trình này nhiều lần đến khi chiết kiệt các chất trong nguyên liệu bột cây. Lọc dung dịch và loại bỏ phần bã còn lại. Dịch lọc cô quay, thu hồi dung môi, cho sản phẩm là cao methanol tổng (130 g, màu xanh đen).

 Hiệu suất điều chế cao methanol tổng: % 20 , 5 100 500 . 2 130    H

Hình 3.2: Ngâm dầm bột cây với methanol và cao methanol tổng

3.3.1.3 Điều chế các cao thành phần từ cao methanol tổng

Để điều chế các cao thành phần từ cao methanol tổng phương pháp được chọn để thực hiện là phương pháp chiết lỏng – lỏng.

a. Điều chế cao petroleum ether

Chuẩn bị bình lóng 500 mL, lấy mỗi lần khoảng 40g cao methanol, cho thêm nước vào với tỉ lệ thể tích cao:nước (1:1) cho vào bình lóng cùng dung môi petroleum ether (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên trong 15 phút, sau đó tách lấy lớp petroleum ether ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết

26

với petroleum ether cho đến khi màu của lớp petroleum ether phía trên nhạt dần và kiểm tra lại bằng SKLM. Chấm phần dịch chiết từ cao petroleum ether nếu không còn vết thì chứng tỏ chất đã được trích hoàn toàn vào dung môi petroleum ether, sau đó gom dịch chiết từ dung môi petroleum ether của các lần chiết lại, cô quay thu hồi dung môi thu được 60,6 g cao petroleum ether.

 Hiệu suất trích cao petroleum ether từ cao methanol tổng: % 6 , 46 100 130 6 , 60    H

b. Điều chế cao chloroform

Lấy lớp nước phía dưới cho vào bình lóng cùng với dung môi chloroform (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp chloroform ở phía dưới, lấy lớp trên tiếp tục chiết với chloroform cho đến khi màu của lớp chloroform phía dưới nhạt dần. Kiểm tra lớp chloroform phía dưới bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi chloroform của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 8,7 g cao chloroform.

 Hiệu suất trích cao chloroform từ cao methanol tổng: % 7 , 6 100 130 7 , 8    H

c. Điều chế cao ethyl acetate

Tương tự lấy lớp nước phía trên cho vào bình lóng cùng với dung môi ethyl acetate (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau đó tách lấy lớp ethyl acetate ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết với ethyl acetate cho đến khi màu của lớp ethyl acetate phía trên nhạt dần. Kiểm tra lớp ethyl acetate phía trên bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi ethyl acetate của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 5,41 g cao ethyl acetate.

 Hiệu suất trích cao ethyl acetate từ cao methanol tổng: % 16 , 4 100 130 41 , 5    H

d. Điều chế cao butanol

Tiếp tục lấy lớp nước phía dưới cho vào bình lóng cùng với dung môi butanol (200 – 300 mL/lần). Lắc đều và để bình lóng yên khoảng 15 phút, sau

27

đó tách lấy lớp butanol ở phía trên, lấy lớp dưới tiếp tục chiết với butanol cho đến khi màu của lớp butanol phía trên nhạt dần. Kiểm tra lớp butanol phía trên bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết thì dừng việc lắc cao lại, gom dịch chiết từ dung môi butanol của các lần chiết đem cô quay thu hồi dung môi thu được 4,82 g cao butanol.

Khi cô quay dịch chiết từ dung môi butanol để có được cao butanol cho thêm dung môi methanol theo tỷ lệ butanol:methanol (1:1). Nếu muốn lấy lại dung môi butanol thêm nước vào, dung môi butanol sẽ nổi lên, thu lấy dung môi butanol.

 Hiệu suất trích cao butanol từ cao methanol tổng: % 71 , 3 100 130 82 , 4    H

3.3.2 Khảo sát cao chloroform

3.3.2.1 Khảo sát lớp mỏng cao chloroform

SKLM cao chloroform ban đầu với các hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng khi khảo sát với hệ dung môi chloroform:methanol (8:2), bản mỏng cho nhiều vết có màu khác nhau và cách nhau tương đối xa. Từ đó có thể thấy rằng các chất có trong cao chloroform này có tính phân cực khác nhau, tiếp tục khảo sát mong rằng sẽ cô lập được chất chứa trong cao chloroform.

Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.3: SKLM cao chloroform

28

3.3.2.2 Phân tích SKC cao chloroform a. SKC cao chloroform

SKC cao chloroform (8,70 g), sử dụng silica gel 60 Scharlau khối lượng silica gel sử dụng là 200 g, cột có đường kính 3 cm, dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE 100% đến Me. Dùng các lọ bi có thể tích 100 mL để hứng dung dịch sau giải ly và theo dõi quá trình SKC bằng SKLM.

Hình 3.4: SKC cao chloroform

Tập trung các lọ cho kết quả SKLM giống nhau, cô quay đuổi dung môi thu được 10 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát cao chloroform

Ký hiệu Dung môi giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g) Nhận xét trên SKLM C1 PE 100% 0,101 Vết tạp, mờ

C2 PE:Ea (9:1) 1,564 3 vết nằm sát nhau, còn dơ nhiều

C3 PE:Ea (8:2) 2,126 1 vết chính, tròn rõ, màu xanh có viền màu hồng, trên đầu còn nhiều vết dơ

C4 Ea:PE (1:1) 0,782 Vệt kéo dài, không có vết chính C5 PE:Ea (3:7) 1,189 1 vết màu vàng nâu, không rõ

ràng, còn dơ nhiều

C6 Ea 100% 1,209 1 vết màu vàng, tròn, rõ, còn có thêm 2 vết dơ phía trên

C7 Ea:Me (9:1) 0,114 Vệt kéo dài, không có vết chính C8 Ea:Me (8:2) 0,185 Vệt kéo dài, không có vết chính C9 Ea:Me (7:3) 1,012 Vệt kéo dài, không có vết chính

29

Qua kết quả thu được từ SKC cao chloroform, nhận thấy ở phân đoạn C3 và C6 cho SKLM có vết chính cụ thể, có thể tiếp tục khảo sát. Tuy nhiên thấy ở phân đoạn C6 gồm 1 vết chính rõ nét, ít dơ và dễ tách hơn, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.

b. Xử lý phân đoạn C6

Tiến hành SKC phân đoạn C6 có khối lượng 1,209 g, lượng silica gel sử dụng là 50 g, cột có đường kính 2 cm dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (8:2) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 10 mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu được 6 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.4.

Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (9:1) Hình 3.5: SKLM và SKC phân đoạn C6

Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn C6

Ký hiệu Dung môi

giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g)

Nhận xét SKLM

C6A PE:Ea (8:2) 0 Không có vết

C6B PE:Ea (7:3) 0,125 Vết tạp, mờ, không rõ ràng C6C PE:Ea (1:1) 0,182 2 vết, mờ, 1 vết màu xanh, 1 vết

màu vàng mờ phía trên, còn dơ nhiều

C6D PE:Ea (3:7) 0,517 1 vết chính màu vàng, tròn, rõ ràng còn dơ đầu

C6E Ea 100% 0,176 Vệt kéo dài, không có vết chính

C6F Me 0,113 Vệt kéo dài, không có vết chính

Qua kết quả SKC phân đoạn C6 nhận thấy rằng ở phân đoạn C6D có 1 vết chính màu vàng tròn, rõ ràng, còn hơi dơ đầu, lượng nhiều, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.

30

c. Xử lý phân đoạn C6D

Tiến hành SKC phân đoạn C6D có khối lượng 0,517 g, sử dụng cột có đường kính 1 cm và 20 g silica gel. Dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (7:3) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần hứng là 5 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu chính 5 phân đoạn được trình bày như Bảng 3.5.

Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.9: SKLM và SKC phân đoạn C6D

Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn C6D

Ký hiệu Dung môi giải

ly cột Khối lượng các phân đoạn (mg)

Nhận xét SKLM

C6D.1 PE:Ea (7:3) 0 Không có vết

C6D.2 PE:Ea (65:35) 0 Không có vết

C6D.3 PE:Ea (6:4) 86 Vết tạp

C6D.5 PE:Ea (3:7) 37 Vết tròn, màu vàng, không còn

C6D.6 Me Không có vết

Qua kết quả SKC phân đoạn C6D, phân đoạn C6D.5 có một 1 vết màu vàng đồng nhất, không còn dơ, khối lượng khoảng 37 mg và có Rf = 0,6 đối với hệ dung môi giải ly SKLM Ea + 1 giọt Me. Hợp chất cô lập được đặt tên là TNCN-C1 và tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ NMR.

31

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thực nghiệm

Qua quá trình khảo sát cao chloroform và một số phân đoạn của cao chloroform, đã phân lập được hợp chất TNCN-C1 và đã tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HR-ESI-MS, HSQC, HMBC.

Đặc trưng vật lý của hợp chất TNCN-C1

 Nhiệt độ nóng chảy: 183°C – 184°C.

 Tan tốt trong methanol.

 Tinh thể màu trắng.

 SKLM với hệ dung môi Ea + 1 giọt Me cho 1 vết màu vàng đồng nhất, có Rf = 0,6 (thuốc hiện hình Vanillin).

1. DC + 1 giọt Me 2. Chloroform 100% 3. Ea + 1 giọt Me (Thuốc hiện hình Vanilin) Hình 4.1: Tinh thể và SKLM hợp chất TNCN-C1 với ba hệ dung môi khác nhau

4.2 Biện luận cấu trúc hóa học của TNCN-C1

Khối phổ HR-ESI-MS (Phụ lục F) của hợp chất TNCN-C1 cho thấy mũi ion phân tử giả [M+ Na]+ có m/z = 344,1110, suy ra TNCN-C1 có khối lượng phân tử là 321,1212.

32

4.2.1 Một số thông tin nhận được từ phổ 1H-NMR của TNCN-C1 (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B) (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B)

 Hợp chất TNCN-C1 có 17H (không tính H của các nhóm –OH, –COOH...)

 Các tín hiệu của vùng từ trường trung bình, δ ppm = 6 – 8 cho thấy sự hiện diện của 4 hydro vòng thơm. Dựa vào hằng số ghép cặp J của các tín

hiệu trong vùng từ trường này có thể dự đoán khung sườn chính có một nhân benzene. Các tín hiệu ở δH = 7,30 (2H, d, J = 9 Hz, =CH–) và δH = 7,10 (2H, d,

J = 8,5 Hz, =CH–) được quy kết 4 hydro này nằm đối xứng nhau trên vòng

thơm, 2 nhóm thế sẽ ở vị trí para với nhau.

 Tín hiệu mũi đơn mạnh, tại δH = 3,83 (2H, s, –CH2–) được quy kết cho hydro của nhóm –CH2– nối với vòng benzene và một nhóm thế R.

 Có 5 tín hiệu ở vùng từ trường cao, δH = 3,50 – 6,00 được quy kết cho các hydro của phần đường. Tín hiệu tại δH = 5,46 (1H, d, J = 2 Hz, CH<) là của hydro anomer.

 Tại δH = 1,10 (3H, d, J = 6 Hz, –CH3) có cường độ tích phân mạnh được quy kết là hydro nhóm –CH3 gắn với gốc đường.

 Tín hiệu mũi đơn, mạnh, tại δH = 2,10 (3H, s, –OCOCH3) là tín hiệu đặc trưng của hydro của nhóm methyl ester –OCOCH3.

4.2.2 Một số thông tin nhận được từ phổ 13C-NMR và phổ DEPT của TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz) TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz)

 Dựa vào phổ 13C-NMR (Phụ lục C), phân tử hợp chất TNCN-C1 có 13 carbon. Trên phổ DEPT (Phụ lục D) cho 3 tín hiệu của carbon tứ cấp >C<, 1 tín hiệu của carbon nhóm –CH2–, 9 tín hiệu của nhóm >C–. Nhưng do có sự đối xứng của vòng thơm nên tín hiệu tại δC = 130,4 và 118,1 biểu diễn 4 carbon.

 Tín hiệu ở vùng từ trường thấp δC = 172,5 được quy kết là carbon của nhóm carbonyl của ester.

 Tín hiệu ở δC = 99,8 được quy kết là tín hiệu của carbon anomer.

 Các tín hiệu có độ dịch chuyển δC = 65 – 76 được quy kết cho các carbon của đường.

33

 Từ các tín hiệu trên, khung sườn cơ bản của hợp chất TNCN-C1 được quy kết là:

Ở vùng từ trường cao có một mũi đôi ở δH = 1,10 (3H, d, J = 6 Hz, –CH3) ứng với nhóm –CH3 (δC ppm = 17,8), vậy phân tử đường này là đường rhamnose. Nhưng do có tín hiệu của nhóm carbonyl và 1 nhóm –CH3 nữa và tín hiệu của hydro anomertại δH = 5,46 (1H, d, J = 2 Hz, CH<) nên phân tử đường này là α-L-rhamnose và đã bị ester hóa ở một nhóm –OH, có cấu tạo như sau:

4.2.3 Một số thông tin nhận được từ phổ HSQC và HMBC của hợp chất TNCN-C1 chất TNCN-C1

 Từ dữ liệu phổ HSQC (Phụ lục D) của TNCN-C1, 2 hydro tại vị trí δH = 3,83 (2H, s) sẽ gắn trực tiếp lên carbon tại vị trí δC = 22,8 (nhóm CH2).

 Từ dữ liệu phổ HMBC (Phụ lục E), xét tín hiệu tại vị trí δH = 3,83 (2H, s, CH2), vẽ 1 đường chấm chấm dọc từ trên xuống dưới sẽ gặp phải 3 tín hiệu giao nhau. Trong 3 tín hiệu giao nhau này, không có tín hiệu nào thể hiện hydro gắn trực tiếp trên carbon tại đó, có một điểm giao nhau tại δC = 119,8 nhưng không thấy tín hiệu trên phổ 13C-NMR, từ đây có thể suy ra trên phổ 13C- NMR của hợp chất TNCN-C1 còn thiếu 1 tín hiệu có thể do cường độ thấp nên bị đường nền che lấp, tín hiệu này có δC = 119,8 nên có thể dự đoán gốc R = –CN.

4.2.4 Kết luận

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC của hợp chất TNCN-C1, công thức cấu tạo của hợp chất TNCN-C1 được đề nghị là 4-(4'-O- Acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl nitrile (Niazirinin), công thức phân tử là C16H19NO6 có khối lượng là 321 hoàn toàn phù hợp với số liệu của phổ HR-ESI-MS. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất đã tách với hợp chất trong tài liệu tham khảo[7] thể hiện sự trùng khớp.

34 Vậy công thức cấu tạo của TNCN-C1 là:

2 1 6 5 4 3 7 8 N O 5' 4' 3' 2' 1' O OH O 6' 7' Me 8' O Me HO

Bảng 4.1: Số liệu phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR của hợp chất TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz) Vị trí carbon Loại carbon 13C- NMR δC ppm 1H-NMR δH ppm, J (Hz) HMBC (1H13C) 1 =C< 157,3 2,6 =CH– 118,1 7,10 (2H, d, J = 8,5, =CH–) 3,5 =CH– 130,4 7,30 (2H, d, J = 9, =CH–) 4 =C< 126,0 7 –CH2– 22,8 3,83 (2H, s, –CH2–CN) H7C8 8 –CN 119,8 1' –CH< 99,8 5,46 (1H, d, J = 2, –CH<) H1'C1 2' –CH< 72,0 4,03 (1H, dd, J1 = 3,5; J2 = 2, –CH<) 3' –CH< 70,2 4,00 (1H, dd, J1 = 9,5; J2 = 3,5, –CH<) 4' –CH< 75,3 5,01 (1H, t, J = 9,8, –CH<) H5'C7'

Một phần của tài liệu phân lập chất từ cao chloroform của thân non chùm ngây (moringa oleifera lam.), họ chùm ngây (moringaceae) (Trang 36)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(61 trang)