3.3.2.1 Khảo sát lớp mỏng cao chloroform
SKLM cao chloroform ban đầu với các hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng khi khảo sát với hệ dung môi chloroform:methanol (8:2), bản mỏng cho nhiều vết có màu khác nhau và cách nhau tương đối xa. Từ đó có thể thấy rằng các chất có trong cao chloroform này có tính phân cực khác nhau, tiếp tục khảo sát mong rằng sẽ cô lập được chất chứa trong cao chloroform.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.3: SKLM cao chloroform
28
3.3.2.2 Phân tích SKC cao chloroform a. SKC cao chloroform
SKC cao chloroform (8,70 g), sử dụng silica gel 60 Scharlau khối lượng silica gel sử dụng là 200 g, cột có đường kính 3 cm, dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE 100% đến Me. Dùng các lọ bi có thể tích 100 mL để hứng dung dịch sau giải ly và theo dõi quá trình SKC bằng SKLM.
Hình 3.4: SKC cao chloroform
Tập trung các lọ cho kết quả SKLM giống nhau, cô quay đuổi dung môi thu được 10 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát cao chloroform
Ký hiệu Dung môi giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g) Nhận xét trên SKLM C1 PE 100% 0,101 Vết tạp, mờ
C2 PE:Ea (9:1) 1,564 3 vết nằm sát nhau, còn dơ nhiều
C3 PE:Ea (8:2) 2,126 1 vết chính, tròn rõ, màu xanh có viền màu hồng, trên đầu còn nhiều vết dơ
C4 Ea:PE (1:1) 0,782 Vệt kéo dài, không có vết chính C5 PE:Ea (3:7) 1,189 1 vết màu vàng nâu, không rõ
ràng, còn dơ nhiều
C6 Ea 100% 1,209 1 vết màu vàng, tròn, rõ, còn có thêm 2 vết dơ phía trên
C7 Ea:Me (9:1) 0,114 Vệt kéo dài, không có vết chính C8 Ea:Me (8:2) 0,185 Vệt kéo dài, không có vết chính C9 Ea:Me (7:3) 1,012 Vệt kéo dài, không có vết chính
29
Qua kết quả thu được từ SKC cao chloroform, nhận thấy ở phân đoạn C3 và C6 cho SKLM có vết chính cụ thể, có thể tiếp tục khảo sát. Tuy nhiên thấy ở phân đoạn C6 gồm 1 vết chính rõ nét, ít dơ và dễ tách hơn, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.
b. Xử lý phân đoạn C6
Tiến hành SKC phân đoạn C6 có khối lượng 1,209 g, lượng silica gel sử dụng là 50 g, cột có đường kính 2 cm dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (8:2) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 10 mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu được 6 phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.4.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (9:1) Hình 3.5: SKLM và SKC phân đoạn C6
Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn C6
Ký hiệu Dung môi
giải ly cột Khối lượng các phân đoạn (g)
Nhận xét SKLM
C6A PE:Ea (8:2) 0 Không có vết
C6B PE:Ea (7:3) 0,125 Vết tạp, mờ, không rõ ràng C6C PE:Ea (1:1) 0,182 2 vết, mờ, 1 vết màu xanh, 1 vết
màu vàng mờ phía trên, còn dơ nhiều
C6D PE:Ea (3:7) 0,517 1 vết chính màu vàng, tròn, rõ ràng còn dơ đầu
C6E Ea 100% 0,176 Vệt kéo dài, không có vết chính
C6F Me 0,113 Vệt kéo dài, không có vết chính
Qua kết quả SKC phân đoạn C6 nhận thấy rằng ở phân đoạn C6D có 1 vết chính màu vàng tròn, rõ ràng, còn hơi dơ đầu, lượng nhiều, do đó sẽ tiếp tục khảo sát phân đoạn này.
30
c. Xử lý phân đoạn C6D
Tiến hành SKC phân đoạn C6D có khối lượng 0,517 g, sử dụng cột có đường kính 1 cm và 20 g silica gel. Dung môi giải ly cột có độ phân cực tăng dần từ PE:Ea (7:3) đến Me. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần hứng là 5 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM giống nhau cô quay thu hồi dung môi thu chính 5 phân đoạn được trình bày như Bảng 3.5.
Dung môi giải ly bản mỏng: chloroform:methanol (8:2) Hình 3.9: SKLM và SKC phân đoạn C6D
Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn C6D
Ký hiệu Dung môi giải
ly cột Khối lượng các phân đoạn (mg)
Nhận xét SKLM
C6D.1 PE:Ea (7:3) 0 Không có vết
C6D.2 PE:Ea (65:35) 0 Không có vết
C6D.3 PE:Ea (6:4) 86 Vết tạp
C6D.5 PE:Ea (3:7) 37 Vết tròn, màu vàng, không còn dơ
C6D.6 Me Không có vết
Qua kết quả SKC phân đoạn C6D, phân đoạn C6D.5 có một 1 vết màu vàng đồng nhất, không còn dơ, khối lượng khoảng 37 mg và có Rf = 0,6 đối với hệ dung môi giải ly SKLM Ea + 1 giọt Me. Hợp chất cô lập được đặt tên là TNCN-C1 và tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ NMR.
31
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thực nghiệm
Qua quá trình khảo sát cao chloroform và một số phân đoạn của cao chloroform, đã phân lập được hợp chất TNCN-C1 và đã tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HR-ESI-MS, HSQC, HMBC.
Đặc trưng vật lý của hợp chất TNCN-C1
Nhiệt độ nóng chảy: 183°C – 184°C.
Tan tốt trong methanol.
Tinh thể màu trắng.
SKLM với hệ dung môi Ea + 1 giọt Me cho 1 vết màu vàng đồng nhất, có Rf = 0,6 (thuốc hiện hình Vanillin).
1. DC + 1 giọt Me 2. Chloroform 100% 3. Ea + 1 giọt Me (Thuốc hiện hình Vanilin) Hình 4.1: Tinh thể và SKLM hợp chất TNCN-C1 với ba hệ dung môi khác nhau
4.2 Biện luận cấu trúc hóa học của TNCN-C1
Khối phổ HR-ESI-MS (Phụ lục F) của hợp chất TNCN-C1 cho thấy mũi ion phân tử giả [M+ Na]+ có m/z = 344,1110, suy ra TNCN-C1 có khối lượng phân tử là 321,1212.
32
4.2.1 Một số thông tin nhận được từ phổ 1H-NMR của TNCN-C1 (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B) (CD3OD, 500 MHz) (Phụ lục B)
Hợp chất TNCN-C1 có 17H (không tính H của các nhóm –OH, –COOH...)
Các tín hiệu của vùng từ trường trung bình, δ ppm = 6 – 8 cho thấy sự hiện diện của 4 hydro vòng thơm. Dựa vào hằng số ghép cặp J của các tín
hiệu trong vùng từ trường này có thể dự đoán khung sườn chính có một nhân benzene. Các tín hiệu ở δH = 7,30 (2H, d, J = 9 Hz, =CH–) và δH = 7,10 (2H, d,
J = 8,5 Hz, =CH–) được quy kết 4 hydro này nằm đối xứng nhau trên vòng
thơm, 2 nhóm thế sẽ ở vị trí para với nhau.
Tín hiệu mũi đơn mạnh, tại δH = 3,83 (2H, s, –CH2–) được quy kết cho hydro của nhóm –CH2– nối với vòng benzene và một nhóm thế R.
Có 5 tín hiệu ở vùng từ trường cao, δH = 3,50 – 6,00 được quy kết cho các hydro của phần đường. Tín hiệu tại δH = 5,46 (1H, d, J = 2 Hz, CH<) là của hydro anomer.
Tại δH = 1,10 (3H, d, J = 6 Hz, –CH3) có cường độ tích phân mạnh được quy kết là hydro nhóm –CH3 gắn với gốc đường.
Tín hiệu mũi đơn, mạnh, tại δH = 2,10 (3H, s, –OCOCH3) là tín hiệu đặc trưng của hydro của nhóm methyl ester –OCOCH3.
4.2.2 Một số thông tin nhận được từ phổ 13C-NMR và phổ DEPT của TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz) TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz)
Dựa vào phổ 13C-NMR (Phụ lục C), phân tử hợp chất TNCN-C1 có 13 carbon. Trên phổ DEPT (Phụ lục D) cho 3 tín hiệu của carbon tứ cấp >C<, 1 tín hiệu của carbon nhóm –CH2–, 9 tín hiệu của nhóm >C–. Nhưng do có sự đối xứng của vòng thơm nên tín hiệu tại δC = 130,4 và 118,1 biểu diễn 4 carbon.
Tín hiệu ở vùng từ trường thấp δC = 172,5 được quy kết là carbon của nhóm carbonyl của ester.
Tín hiệu ở δC = 99,8 được quy kết là tín hiệu của carbon anomer.
Các tín hiệu có độ dịch chuyển δC = 65 – 76 được quy kết cho các carbon của đường.
33
Từ các tín hiệu trên, khung sườn cơ bản của hợp chất TNCN-C1 được quy kết là:
Ở vùng từ trường cao có một mũi đôi ở δH = 1,10 (3H, d, J = 6 Hz, –CH3) ứng với nhóm –CH3 (δC ppm = 17,8), vậy phân tử đường này là đường rhamnose. Nhưng do có tín hiệu của nhóm carbonyl và 1 nhóm –CH3 nữa và tín hiệu của hydro anomertại δH = 5,46 (1H, d, J = 2 Hz, CH<) nên phân tử đường này là α-L-rhamnose và đã bị ester hóa ở một nhóm –OH, có cấu tạo như sau:
4.2.3 Một số thông tin nhận được từ phổ HSQC và HMBC của hợp chất TNCN-C1 chất TNCN-C1
Từ dữ liệu phổ HSQC (Phụ lục D) của TNCN-C1, 2 hydro tại vị trí δH = 3,83 (2H, s) sẽ gắn trực tiếp lên carbon tại vị trí δC = 22,8 (nhóm CH2).
Từ dữ liệu phổ HMBC (Phụ lục E), xét tín hiệu tại vị trí δH = 3,83 (2H, s, CH2), vẽ 1 đường chấm chấm dọc từ trên xuống dưới sẽ gặp phải 3 tín hiệu giao nhau. Trong 3 tín hiệu giao nhau này, không có tín hiệu nào thể hiện hydro gắn trực tiếp trên carbon tại đó, có một điểm giao nhau tại δC = 119,8 nhưng không thấy tín hiệu trên phổ 13C-NMR, từ đây có thể suy ra trên phổ 13C- NMR của hợp chất TNCN-C1 còn thiếu 1 tín hiệu có thể do cường độ thấp nên bị đường nền che lấp, tín hiệu này có δC = 119,8 nên có thể dự đoán gốc R = –CN.
4.2.4 Kết luận
Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC của hợp chất TNCN-C1, công thức cấu tạo của hợp chất TNCN-C1 được đề nghị là 4-(4'-O- Acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl nitrile (Niazirinin), công thức phân tử là C16H19NO6 có khối lượng là 321 hoàn toàn phù hợp với số liệu của phổ HR-ESI-MS. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất đã tách với hợp chất trong tài liệu tham khảo[7] thể hiện sự trùng khớp.
34 Vậy công thức cấu tạo của TNCN-C1 là:
2 1 6 5 4 3 7 8 N O 5' 4' 3' 2' 1' O OH O 6' 7' Me 8' O Me HO
Bảng 4.1: Số liệu phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR của hợp chất TNCN-C1 (CD3OD, 125 MHz) Vị trí carbon Loại carbon 13C- NMR δC ppm 1H-NMR δH ppm, J (Hz) HMBC (1H13C) 1 =C< 157,3 2,6 =CH– 118,1 7,10 (2H, d, J = 8,5, =CH–) 3,5 =CH– 130,4 7,30 (2H, d, J = 9, =CH–) 4 =C< 126,0 7 –CH2– 22,8 3,83 (2H, s, –CH2–CN) H7C8 8 –CN 119,8 1' –CH< 99,8 5,46 (1H, d, J = 2, –CH<) H1'C1 2' –CH< 72,0 4,03 (1H, dd, J1 = 3,5; J2 = 2, –CH<) 3' –CH< 70,2 4,00 (1H, dd, J1 = 9,5; J2 = 3,5, –CH<) 4' –CH< 75,3 5,01 (1H, t, J = 9,8, –CH<) H5'C7' 5' –CH< 68,6 3,77 (1H, m, –CH<) 6' –CH3 17,8 1,10 (3H, d, J = 6, –CH3) 7' – OCO– 172,5 8' –CH3 21,0 2,10 (3H, s, –OCOCH3)
35
Bảng 4.2: So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất TNCN-C1 với dữ liệu phổ 1H-NMR (CD3OD, 300 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 75 MHz) Niazirinin (4-(4'-O-Acetyl-α-L- rhamnosyloxy)benzyl nitrile) Vị trí carbon 13C-NMR 1H-NMR TNCN- C1 (CD3OD) δC ppm Niazirinin (CDCl3) δC ppm TNCN-C1 (CD3OD) δH ppm, J (Hz) Niazirinin (CDCl3) δH ppm, J (Hz) 1 157,5 156,0 2,6 118,1 116,9 7,10 (2H, d, J = 8,5, =CH–) 7,05 (2H, d, J = 8,7, =CH–) 3,5 130,4 129,3 7,30 (2H, d, J = 9, =CH–) 7,24 (2H, d, J = 8,7, =CH–) 4 126,0 131,7 7 22,8 22,9 3,83 (2H, s, –CH2–CN) 3,68 (2H, s, –CH2– CN) 8 119,8 123,7 1' 99,8 97,2 5,46 (1H, d, J = 2, –CH<) 5,55 (1H, d, J = 1,6, –CH<) 2' 72,0 70,7 4,03 (1H, dd, J1 = 3,5; J2 = 2, –CH<) 4,15 (1H, dd, J1 = 3,5; J2 = 1,6, –CH<) 3' 70,2 70,1 4,00 (1H, dd, J1 = 9,5; J2 = 3,5, –CH<) 4,09 (1H, dd, J1 = 9,6; J2 = 3,5, –CH<) 4' 75,3 75,5 5,01 (1H, t, J = 9,8, –CH<) 4,87 (1H, t, J = 9,6, –CH<) 5' 68,6 66,4 3,77 (1H, m, –CH<) 3,58 (1H, qd, J1 = 9,6; J2 = 6,3, –CH<) 6' 17,8 17,5 1,10 (3H, d, J = 6, CH3) 1,19 (1H, d, J = 6,3, –CH3) 7' 172,5 172,0 8' 21,0 21,1 2,10 (3H, s, –OCOCH3) 2,13 (1H, s, –OCOCH3)
36
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
Thân non chùm ngây được thu hái tại khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ, khối lượng thân non thu được là 25 kg. Qua quá trình xử lý, phơi và sấy ở nhiệt độ 60°C thu được 2,5 kg bột khô. Ngâm dầm bột cây với methanol thu được 130 g cao methanol tổng. Tiếp tục chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi petroleum ether, chloroform, ethyl acetate và butanol thu được 60,6 g cao petroleum ether; 8,7 g cao chloroform; 5,41 g cao ethyl acetate; 4,82 g cao butanol.
SKLM cao chloroform ban đầu với các hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng khi khảo sát với hệ dung môi chloroform:methanol (8:2), bản mỏng cho nhiều vết có màu khác nhau và cách nhau tương đối xa. Từ đó, thấy rằng cao cloroform chứa nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Tiến hành khảo sát cao chloroform bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển với dung môi giải ly cột bắt đầu từ petroleum ether 100% đến methanol thu được 10 phân đoạn (C1 – C10). SKLM phân đoạn C3 (2,126 g) và C6 (1,209 g) cho bản mỏng có vết chính cụ thể có thể khảo sát tiếp, do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn không thể khảo sát hết cả hai phân đoạn nên đã chọn phân đoạn C6 gồm 1 vết chính rõ nét, ít dơ và dễ tách để tiến hành khảo sát. Qua quá trình SKC phân đoạn C6 đã phân lập và tinh chế được 37 mg một hợp chất được đặt tên là TNCN-C1.
Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và tài liệu tham khảo, đã đề nghị được cấu trúc của hợp chất TNCN-C1 là 4-(4'-O-Acetyl- α-L-rhamnosyloxy)benzyl nitrile.
Hợp chất đã được cô lập và xác định cấu trúc từ nguyên liệu thân non chùm ngây tại Cần Thơ phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của tác giả Rubeena Saleem năm 1995 [7].
Hàm lượng của hợp chất TNCN-C1 so với khối lượng cao chloroform là 0,43%.
37
Trong các nghiên cứu trước, đã cô lập được 4-(4'-O-Acetyl-α-L- rhamnosyloxy)benzyl nitrile từ lá của chùm ngây , kết quả cô lập được hợp chất TNCN-C1 từ thân non chùm ngây là một đóng góp mới về thành phần hóa học trong từ bộ phận cây chùm ngây.
5.2 Kiến nghị
Tiếp tục khảo sát các phân đoạn còn lại của cao chloroform và các cao thành phần khác.
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Perveen, A. and Qaiser.M (2009). Pollen flora of pakistan – LXIII. Moringaceae. Deparment of Botany, University of Karachi, Karachi, Pakistan.
[2] Phạm Thị Trường Thọ, DSCK II Đỗ Huy Bích (2007). 101 cây thuốc với sức khỏe sinh sản phụ nữ. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. Trang 69 – 70.
[3] Nguyễn Bảo Trân (2010). Khảo sát tác động chống oxy hóa của lá cây chùm ngây Moringa oleifera Lam., Morigaceae. Luận văn thạc sỹ dược học, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.
[4] Võ Văn Chi (2005). 250 cây thuốc thông dụng nhất. Nhà xuất bản Hải Phòng. Hải Phòng.
[5] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập và Trần Đoàn (2004). Cây thuốc và động vật dùng làm thuốc. Viện Dược Liệu. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. Trang 458 – 460.
[6] Jed, W. and Fahey, Sc. (2005). Moringa oleifera: A Review of the Medical Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties (Part 1). Trees for Life Journal.
[7] Rubeena Saleem (1995). Stuydies in the chemical constituents of
Moringa oleifera Lam., and preparation of potential biologically significant
derivatives of 8-Hydroxyquinolone. H.E.J Research Institue of Chemistry University of Karachi, Pakistan.
[8] Pari, L. and Kumar, N.A. (2008). Hepatoprotective activity of
Moringa oleifera. Pharmacognosy reviews, 2: 7-13.
[9] Foidl, N., Makkar, H.P.S. and Becker, K. (2001). The potential of
Moringa oleifera for agricultural and industrial uses. International Journal of
Toxicology, 4: 279-286.
[10] Võ Hồng Thi, Hoàng Hưng và Lương Minh Khánh (2012). Nghiên cứu sử dụng hạt cây chùm ngây (Moringa oleferia) để làm trong nước tại Việt Nam. Tạp chí khoa học. Đại học Huế. Tập 75A, số 6 (2012), 153 – 164.
[11] Anwar, F., Latif, S., Ashraf, M. and Gilani, A.H. (2007). Moringa
oleifera: a food plant with multiple medicinal usue. Phytother Res. Jan, 21(1):
17 – 25.
[12] Dahot, M.U. (1988). Vitamin content of flowers and seeds of
Moringa oleifera. Pak. J. Biochem., 21: 1-24.
[13] Padmarao, P., Acharya, B.M. and Dennis, T.J. (1996), Pharmacognostic study on stembark of Moriga oleifera Lam.. Bullein of
Medico – Ethno – Botanical Research, 17:141 – 151.
[14] Morton, J.F. (1991). The Horseradish tree, Moringa pterigosperma
(Moringaceae). A boon ta arid lands, Econ Bot, 45: 318 – 333.
[15] Bhatnagar, S.S., Santapau, H., Desai, J.D.H., Yellore, S. and Rao, T.N.S. (1961). Biological activity of Indian medicinal plants. Part 1,
39
Antibacterial, antitubercular and antifungal action, Indian J. Med Res, 49: 799 – 805.
[16] Mehta, L.K., Balaraman, R., Amin, A.H., Bafna, P.A. and Gulati,