2.5.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase
Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin. Các enzyme có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo,… Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men của nấm men.
Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm. Hiện nay, có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase: gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme nhóm khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các enzyme này thủy phân liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase: gồm có β-amylase (EC 3.2.1.2) và γ-amylase (EC 3.2.1.3). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004). Amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối và rượu loãng.
Hình 2.4: Các loại enzyme endoamylase và exoamylase
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)
2.5.2 Cơ chất của enzyme amylase
2.5.2.1 Tinh bột
Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu ở các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì,… trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004). Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin. Các loại tinh bột đều có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin. Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, rượu và ete. Amylose dễ tan trong nước nóng và tạo độ nhớt của dung dịch. Amylopectin khi hòa tan trong nước nóng sẽ tạo ra dung dịch rất nhớt.
Enzyme khử nhánh
Endoamylase
α-amylase
Khử trực tiếp
α-dextrin 6-glucanohydrolase (pullulanase) Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosydase) và amylo-1,6-glucosidase Enzyme amylase Exoamylase β-amylase γ-amylase
Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ các gốc α-D- glucopyranosyl, liên kết với nhau bở các gốc α-1,4 glucoside dài khoảng 300 -1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc glucose tạo thành hình lục giác. Cùng với amylopectin, các phân tử amylose tham gia tạo nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật. Amylose tạo thành màu xanh khi tác dụng với Iodine, nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗi thẳng di bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh.
Amylopectin: là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốc α-D- glucopyranosyl liên kết với nhau bởi các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Mức độ polyme hóa từ amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu. Cấu trúc phân mạch của nó bao gồm 1 nhánh trung tâm (chứa liên kết 1,4) từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose. Khối lượng phân tử của amylopectin khoảng 500.000 đến 1.000.000. Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt tinh bột, dung dịch amylopectin có độ nhớt cao.
Tinh bột có thể bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme amylase hoặc acid tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn gọi là dextrin. Các dextrin có thể bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các gốc glucose.
2.5.2.2 Glycogen
Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccharide dự trữ của người và động vật. Phân tử glucogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng phân nhánh giống như amylopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucose trong phân tử liên kết với nhau qua liên kết α-1,4 glucoside, liên kết α-1,6 glucoside ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glycogen bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme Amylase hoặc acid. Khi thủy phân hoàn toàn glycogen sẽ nhận được α-D-glucose. Ở động vật và người, glycogen chủ yếu tập trung ở gan.
Hình 2.5 : Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase
(Nguồn: http://doc.edu.vn/tai-lieu/tieu-luan-tong-quan-ve-enzyme-amylase-23950/)
2.5.3 Các loại enzyme
2.5.3.1 α-Amylase(1,4- α-glucan 4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)
α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là một enzyme nội bào (endoamylase). α-Amylase không chỉ có thể thủy phân hồ tinh bột mà còn có khả năng thủy phân tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme α-Amylase là quá trình đa giai đoạn:
Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi các α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide khoảng 6 – 7 gốc glucose.
Sau đó: các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colangen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì
không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α -amylase:
Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra- và trimaltose di-và monosaccharide
Amylose oligosaccharide polyglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
Đặc tính: α -amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác, mỗi loại α -amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α -amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzyme. α -amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
- pH tối thích cho hoạt động của α -amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7 - 5,4).
- α -amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58-60o C
Hoạt tính của enzyme α-amylase sẽ thay đổi trong suốt quá trình nảy mầm của hạt gạo, hoạt tính enzyme α-amylase của hạt gạo chưa nảy mầm là rất thấp vì hạt đang ở trạng thái ngủ vì vậy enzyme không được kích hoạt. Trong quá trình nảy mầm từ 0 giờ đến 96 giờ thì hoạt tính của α-amylase ngày càng tăng (Moogngarm và Saetung, 2010).
α-amylase se α -amylase α -amylase y e
Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Palmiano và Juliano (1972), hoạt tính của enzyme α- amylase tăng sau 5 ngày nảy mầm ở ngoài sáng và 4 ngày trong tối khi kiểm soát được sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy hoạt tính của enzyme có thể tăng trong suốt quá trình nảy mầm, tuy nhiên không thể kiểm soát được sự phát triển của vi sinh vật nên sau 36 giờ thì hoạt tính của enzyme giảm.
Ngoài thời gian ủ, hoạt tính của enzyme α-amylase còn phụ thuộc vào pH dung dịch ngâm. Theo Bertoft và cộng sự (1984), hoạt tính của enzyme α-amylase ảnh hởng bởi nhiệt độ và pH. Enzyme α-amylase hoạt động tốt ở nhiệt độ 65 – 70oC, pH từ 5 – 5,5.
2.5.3.2 β-amylase (1,4-α-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)
β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Trong hạt ngũ cốc nảy mầm, β -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α -1,4-glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Ở lúa, β-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô.
Cơ chế tác dụng của β-Amylase:
β-amylase là một enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4- glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng cạnh liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside và được gọi là β-dextrin.
Tinh bột maltose (54-58%) + β -dextrin (42-46%)
(glucogen)
Lượng tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase lên tới 95%.
Đặc tính:
β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histidine.
β-amylase không bền khi có Ca2+, β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, inodineoacetamide, iodine, ozon,…
β-amylase chịu nhiệt kém hơn α –amylase nhưng bền hơn với acid. β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC. Nhiệt độ tối thích của β-amylase là 55oC, pH tối thích trong khoảng 5,1 – 5,5.
2.5.3.3 γ-Amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) (E.C.3.2.1.3)
Glucoamylase có khả năng thủy phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucoside. Khi thủy phân liên kết α-1,4 trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: glucoamylase, amyloglucosidase; taka-amylase B; γ-amylase,… Là enzyme ngoại bào. Ngoài ra, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α -1,2 lẫn α -1,3 glucoside.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột glycogen, amylopectin, dextrin, pentose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các amylase khác. Glucoamylase thủy phân giải phóng polysaccharide có nhánh như amylopectin, glycogen, β-amylase bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số các glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 55o C. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+.
2.5.3.4 Oligo-1,6-glucoside hay dextrinase tới hạn (dextrinase-6-glucanhydrolase)
Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong isomaltose, pentose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm.
Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme (E.C.3.2.1.9) và dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-1,6-glucanhydrolase (E.C.3.2.1.33). Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase do đó trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 40oC và pH tối thích là 5,1.
2.5.3.5 Pullunase (E.C.3.2.1.4)
Pullunase thủy phân liên kết α-1,6 trong tinh bột, glucogen, pululan và các dextrine tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này.
pH tối thích của enzyme pullunase là 5,1 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 45,7oC. Enzyme này có khả năng thủy phân các dextrin phân tử thấp gồm 2 gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside
2.5.3.6 Transglucoside (E.C.3.2.1.68)
Transglucoside luôn tương tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính trasferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây sự nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucoside không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp isomaltose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và chuyển nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6- glucoside để tạo thành maltose hoặc isomaltose (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)
2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Hoạt tính do enzyme xúc tác phụ thuộc vào khá nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, hệ đệm, các ion kim loại, các chất hoạt hóa và các chất kiềm hãm.
2.5.4.1 Nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme (Trịnh Lê Hùng, 2005)
V = k.[E]
Trong đó : V là vận tốc phản ứng [E] là nồng độ enzyme
Nồng độ của enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Cũng có trường hợp nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm lại.
2.5.4.2 Nồng độ cơ chất
Với lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất thì ban đầu hoạt tính enzyme tăng dần và vận tốc phản ứng tăng tuyến tính theo nồng độ cơ chất. Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất đến mức cực đại hoạt tính của enzyme không tăng vì tất cả trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất và vận tốc phản ứng sẽ không đổi (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
2.5.4.3 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất tới đến phản ứng của enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng tới một giới hạn nhất định. Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần
và dẫn đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng của enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở 40-50oC. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
2.5.4.4 pH
pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có phản ứng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. pH tương ứng của tốc độ phản ứng của enzyme cao nhất gọi là pH tối ưu (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
2.5.4.5 Chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa góp phần làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme. Bản chất hóa học của chúng khác nhau, có thể là những anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ. Các chất này thường kết hợp trực tiếp với phân tử enzyme làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt độ xúc tác. Tuy nhiên tác dụng kích hoạt chỉ giới hạn ở một nồng độ nhất định, nếu vượt qua giới hạn thì sẽ bị tác dụng ngược lại (Trịnh Lê Hùng, 2005).
2.5.4.6 Chất kiềm hãm
Hoạt động của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ của enzyme nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme được gọi là các chất kiềm hãm hay chất ức chế (Lê Ngọc Tú và cộng sự,
2004). Chất kiềm hãm có tác dụng sau đây: kiềm hãm cạnh tranh, kiềm hãm không cạnh tranh, kiềm hãm phi cạnh tranh, kiềm hãm hỗn hợp và kiềm hãm do thừa cơ chất (Phạm Thị Trân Châu, Lê Tuấn Nghĩa, 2007).
2.5.5 Các quá trình enzyme xảy ra khi hạt nảy mầm
Trong hạt khô, enzyme ở dạng liên kết và chúng được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra, còn có một số enzyme được tổng hợp mới.
α-Amylase: enzyme này hoàn toàn không hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính của enzyme amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15-17oC, hoạt tính của α-Amylase đạt tới cực đại vào ngày thứ 10-12 của quá trình nảy mầm. Ở nhiệt độ 28- 30oC, hoạt tính của enzyme này đạt cực đại ở ngày 5-8 (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
β-amylase: enzyme β-amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng lên trong quá trình hạt nảy mầm. Thời