Việc theo dõi hoạt tính của bột mốc trong quá trình bảo quản là rất cần thiết nhằm đánh giá tính ổn định của bột mốc trƣớc khi tiến hành sản xuất với qui mô lớn. Trong thí nghiệm này, bột mốc đƣợc sản xuất và bảo quản trong bao bì PE và trữ ở nhiệt độ phòng. Kết quả xác định hoạt tính của bột mốc theo thời gian bảo quản đƣợc thể hiện ở hình 4.8.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Hình 4.8 Lƣợng đƣờng sinh ra của bột mốc theo thời gian bảo quản
Từ kết quả trên cho thấy hoạt tính đƣờng hóa của bột mốc thay đổi theo thời gian. Sau 28 ngày bảo quản thể dịch dịch rỉ giảm nhiều nhất, độ Brix và hàm lƣợng đƣờng khử giảm nhƣng không đáng kể. Từ ngày đầu tiên bảo quản đến 14 ngày sau bảo quản hàm lƣợng đƣờng khử giảm nhƣng không có sự khác biệt ý nghĩa, sau 28 ngày bảo quản thì hàm lƣợng đƣờng khử giảm mạnh tuy nhiên vẫn còn cao. Nhƣ vậy sau 28 ngày bảo quản bột mốc trong bao bì PE ở nhiệt độ phòng thì hoạt tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc vẫn còn ổn định.
Means and 95.0 percent LSD Intervals
Lƣ
ợng đƣờng sinh ra
(g)
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
Dòng nấm mốc thuần M1.1 đƣợc phân lập và tuyển chọn từ 4 loại bánh men thị trƣờng, có khả năng đƣờng hóa cao nhất, dòng nấm mốc này thủy phân cơm từ 20 g gạo sinh ra 15,1 ml dịch rỉ và 20,12 (g/100ml) hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. Khảo sát hoạt tính đƣờng hóa của nấm mốc từ các vị thuốc bắc đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp hoạch định thí nghiệm Plackett-Burman.
Kết quả cho thấy tế tân có ảnh hƣởng tốt hơn các loại thuốc bắc khác về tăng khả năng đƣờng hóa của nấm mốc.
Kết quả khảo sát 3 mức hàm lƣợng tế tân bổ sung 1,5 g, 3 g, 4,5 g vào 10 g bột nấm mốc cho thấy khi bổ sung mức cao (4,5 g) tế tân, hoạt tính đƣờng hóa cao, khi thủy phân gạo đã hồ hóa từ 20 g gạo sinh ra 20,8 ml dịch rỉ và hàm lƣợng đƣờng khử 22,93 (g/100ml).
Nhiệt độ sấy 45 oC đến độ ẩm 8 % là thích hợp nhất giữ đƣợc hoạt tính của nấm mốc.
Kết quả cho thấy bột mốc tồn trữ trong bao bì PE cách ẩm và ở nhiệt độ phòng trong 28 ngày bảo quản có hoạt tính đƣờng hóa giảm dần nhƣng còn khá tốt để sử dụng (3,15 g lƣợng đƣờng sinh ra).
5.2 Kiến nghị
- Khảo sát thời gian thủy phân tinh bột để thu đƣợc lƣợng đƣờng khử nhiều nhất. - Khảo sát mật số bào tử mốc tối ƣu cho quá trình nuôi cấy để tạo chế phẩm nấm mốc có hoạt tính đƣờng hóa cao nhất.
- Khảo sát các điều kiện bảo quản bột mốc ở các mức nhiệt độ và độ ẩm khác nhau, loại bột sử dụng khi phối trộn với mốc giống.
- Khảo sát khả năng sống sót và đặc tính sinh hóa của các chủng nấm mốc trong thời gian bảo quản dài hơn để tìm ra thời gian tối đa nhất.
- Tạo ra chế phẩm nấm mốc tiện lợi lƣu hành đƣợc trên thị trƣờng.
- Cần có biện pháp kiểm soát vấn đề sinh độc tố của nấm mốc vì một số loài nấm mốc có khả năng sinh độc tố ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Lê Thanh Mại, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2009), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Lê Xuân Phƣơng (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội. Lƣơng Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp.
Lý Nguyễn Bình (2007), Giáo trình enzyme thực phẩm, bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Ngô Thị Phƣơng Dung và Huỳnh Xuân Phong (2009), Sản xuất nấm mốc từ Amylomycesrouxii, Tạp chí Khoa học 11, 179 - 185.
Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng (2000), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Đức Lƣợng (1998), Thực phẩm lên men truyền thống, Công nghệ vi sinh vật - tập 3, NXB Đại học Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lƣợng (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học - tập 2, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, NXB Đại Học Quốc gia.
Nguyễn Đức Lƣợng (2004), Công nghệ vi sinh vật - tập 1, NXB Đại học Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Văn Phƣớc (1979), Công nghệ sản xuất cồn, Bộ môn cung cấp thực phẩm, Hà Nội. Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Adam, M.R và Moss, M.O (1995), Food Microbiology, The Royol Society of Chemistry Cambridge.
Casey, G.P và W.M Ingledew (1986), Ethanol tolerance in yeasts, Micobio. Ellis, J. J và L. J Rhodes (1976), The genus Amylomyces, Mycologia.
Nout, Rob (1999), Food fermentation, Wageningen Agricultural University.
Samon, R.A và Ellen S. van Reenen Hoekstra (2000), Introduction to food-and airbuorne fungi. Sixth edition. Centraalbureua voor Schmimmelcultures. Netherlands.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
PHỤ LỤC A
CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc
Phân lập nấm mốc là quá trình tách riêng nấm mốc đó từ mẫu vật hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống ở dạng thuần khiết.
Nấm mốc ở dạng thuần khiết là giống nấm mốc đƣợc tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Việc nuôi cấy nấm mốc đòi hỏi kỹ thuật vô trùng, nhằm ngăn ngừa giống nấm mốc và các dung dịch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật không mong muốn. Đồng thời cũng giúp cho ngƣời làm thí nghiệm tránh bị nhiễm các vi sinh vật gây bệnh.
* Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào nấm mốc
- Nuôi cấy các tế bào trên môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để nấm mốc phát triển riêng lẽ và cách biệt nhau
* Quá trình phân lập nấm mốc ở dạng thuần
- Chuẩn bị giống để phân lập
Nguồn giống ban đầu đƣợc nghiền mịn, hòa tan mẫu trong nƣớc cất vô trùng và cho vào môi trƣờng nuôi cấy thích hợp. Ủ mẫu ở nhiệt độ thích hợp để nấm mốc phát triển tốt. - Chọn các khuẩn lạc đặc trƣng
Chọn ra những nấm mốc mang các đặc điểm khác nhau về kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. Sau đó, sử dụng que cấy lấy khuẩn lạc đặc trƣng phát triển riêng lẽ rồi cấy vào môi trƣờng thích hợp. Đem ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để kiểm tra tính thuần khiết của nấm mốc.
- Kiểm tra tính thuần khiết của nấm mốc
Có nhiều cách để kiểm tra tính thuần khiết của nấm mốc (kiểm tra dƣới kính hiển vi, kiểm tra bằng phƣơng pháp cấy trang, đổ đĩa và cấy ria). Phƣơng pháp cấy trang, đổ đĩa và cấy ria là phƣơng pháp tiện lợi và có ý nghĩa thực tiễn nhất. Sau khi cấy và ủ mốc, nếu thấy trên bề mặt môi trƣờng đĩa xuất hiện những khuẩn lạc có cùng kích thƣớc, hình dạng, màu sắc…thì chứng tỏ giống mới phân lập là giống thuần chủng.
2. Phƣơng pháp xác định mật số bào tử nấm mốc bằng kính hiển vi.
Sau khi nấm mốc nuôi cấy trên môi trƣờng PGA thu hoạch sinh khối với lƣợng nƣớc muối sinh lý đã khử trùng. Tiến hành lấy 1 giọt dịch huyền phù bào tử nấm mốc cho lên
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
buồng đếm, đậy kính tấm lame, đặt lên kính hiển vi kiểm tra mật số. Mật số bào tử đƣợc xác định theo công thức. N (tế bào/ml) = 6 10 1 4 f n Trong đó, N: lƣợng tế bào/ml
n: số tế bào trung bình trong một ô lớn v: thể tích 1 ô lớn (v = 4 x 10 -6
ml) f: hệ số pha loãng
(Dùng buồng đếm Newbauer: Loại buồng đếm này có (16 ô vuông lớn) x (16 ô vuông nhỏ).
Thể tích 1 ô vuông lớn: v = (0,0025 mm2 x 16) x 0,1 mm = 4 x 10-3 mm3 = 4 x 10-6 ml).
3. Phƣơng pháp xác định mật số bào tử nấm mốc trong bột mốc thuần.
Cân 1 g bột mốc cho vào 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,85 % w/w) trộn đều mẫu đến nồng độ thích hợp cho quá trình xác định mật số nấm mốc. Hút 1 ml dịch huyền phù mốc cho vào đĩa petri vô trùng cùng với 15 ml môi trƣờng PGA (làm nguội ở nhiệt độ 45 oC), lắc đều mẫu. Sau đó mẫu đƣợc ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 24 giờ. Khuẩn lạc mốc xuất hiện sau thời gian ủ mốc sẽ đƣợc ghi nhận và tính đƣợc số lƣợng bào tử mốc/g bột mốc khô (cfu/g bột mốc) dựa trên công thức:
d n n C X ) 1 , 0 ( 1 2 Trong đó,
C: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc ở các đĩa, cfu/ml, cfu/g n1: Số đĩa đếm đƣợc ở nồng độ pha loãng thứ nhất
n2: Số đĩa đếm đƣợc ở nồng độ pha loãng thứ hai d: Độ pha loãng cho đĩa đếm thứ nhất
X: số khuẩn lạc trên 1 g hoặc 1 ml
4. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải tinh bột.
Môi trƣờng sử dụng để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc là môi trƣờng thạch – tinh bột. Cấy các chủng nấm mốc lên môi trƣờng thạch – tinh bột, để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau đó, đổ dung dịch Lugol lên môi trƣờng thạch – tinh bột. Nếu có vòng thủy phân giải quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
không có khả năng phân giải tinh bột, dùng thƣớc đo vòng phân giải tinh bột và ghi nhân kết quả.
5. Phƣơng pháp hàm lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp Lane – Eynon * Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch NaOH 30 %, 10 % - HCl đậm đặc - Dung dịch acetate chì 30 % - Na2SO4 bão hòa - Na2CO3 10 %
- Dung dịch Fehling A: 69,28 g CuSO4 tinh thể pha với nƣớc cất đến 1000 ml.
- Dung dịch Fehling B: 346 g kali natri tartrat, 100g NaOH pha với nƣớc cất đến 1000ml. - Methyl xanh 1 % trong nƣớc
* Nguyên tắc
Trong môi trƣờng kiềm, các hợp chất monosaccharide tồn tại ở dạng endiol, dễ dàng khử Cu2+ tạo thành Cu2O. Khi cho dung dịch đƣờng tác dụng hết với một lƣợng biết trƣớc hỗn hợp thuốc thử Fehling, có thể suy ra hàm lƣợng đƣờng trong mẫu phân tích.
* Tiến hành
- Chuẩn bị nguyên liệu.
+ Cân m (g) mẫu cho vào bình tam giác 100 ml.
+ Cho thêm vào bình 50 ml nƣớc cất, dùng dung dịch Na2CO3 10 % để trung hòa dung dịch (dùng giấy quì tím làm chỉ thị màu).
+ Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml. Kết tủa protein với 3 ml dung dịch acetate chì 30 %. Loại bỏ acetate chì bằng 10-15 ml dung dịch Na2SO4 bão hòa. Thêm nƣớc cất với vạch định mức, lắc đều và lọc.
- Định lƣợng đƣờng khử trong dịch lọc.
+ Cho vào bình tam giác 100 ml hỗn hợp 5 ml Fehling A và 5 ml Fehling B, lắc đều sau đó cho 15 ml dịch lọc. Đem đun sôi trên bếp và quan sát màu của dung dịch.
+ Nếu màu xanh của dung dịch Fehling biến mất, nghĩa là đƣờng dƣ, cần pha loãng dịch lọc và phân định lại.
+ Nếu màu xanh của hỗn hợp Fehling chƣa mất, thêm từ từ từng ml dung dịch đƣờng vào bình tam giác, đun sôi và quan sát cho đến khi có kết tủa màu đỏ gạch, dung dịch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt methyl xanh vào dung dịch đang sôi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc thể tích và tra bảng để tính ra hàm lƣợng đƣờng.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm Tính toán kết quả Hàm lƣợng đƣờng khử (%) = Bảng i Bảng giá trị thực nghiệm để xác định hàm lƣợng đƣờng khử. ml dd đƣờng sử dụng mg đƣờng nghịch chuyển ml dd đƣờng sử dụng mg đƣờng nghịch chuyển ml dd đƣờng sử dụng mg đƣờng nghịch chuyển ml dd đƣờng sử dụng mg đƣờng nghịch chuyển 15 336 24 213,3 33 156,06 42 124,2 16 316 25 204,8 34 152,2 43 121,4 17 298 26 197,4 35 147,09 44 118,7 18 282 27 190,4 36 143,9 45 116,1 19 267 28 183,7 37 140,2 46 113,7 20 254,5 29 177,6 38 136,6 47 111,4 21 242,9 30 171,7 39 133,3 48 109,2 22 231,8 31 166,3 40 130,1 49 107,1 23 222,2 32 161,2 41 127,1 50 105,1 6. Các loại môi trƣờng a. Thành phần môi trƣờng
* Môi trƣờng phân lập nâm mốc (PGA)
Khoai tây 100 g
Số tra bảng * HSPL * 100 Khối lƣợng mẫu (g) * 1000
Ngành: Công nghệ Thực phẩm Glucose 10 g Agar 6 g (NH4)2PO4 1 g KH2PO4 1 g Nƣớc 500ml * Môi trƣờng trữ giống nấm mốc Khoai tây 100 g Glucose 10 g Agar 6 g (NH4)2PO4 1 g KH2PO4 1 g Nƣớc 500 ml MgSO4 0,25 g CaSO4 0,1 g b. Chuẩn bị môi trƣờng
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch sau đó cắt thành những lát mỏng và nhỏ. Cân 100 g khoai tây và 400 ml nƣớc cất cho vào bình tam giác, đun sôi trong 30 phút. Thu đƣợc dịch trích khoai tây, đồng thời cho các thành phần còn lại của môi trƣờng vào và trộn đều, thêm nƣớc cất đến thể tích 500 ml. Đun sôi hỗn hợp này đến khi agar tan hoàn toàn. Tiếp theo, tiệt trùng hỗn hợp này ở nhiệt độ 121 oC trong thời gian 15 phút. Môi trƣờng này có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 oC.
7. Xác định ẩm bằng phƣơng pháp sấy khô
Xác định khối lƣợng cốc khô: Sấy cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 oC đến khi khối lƣợng cốc không đổi, sau khi sấy xong, đem làm nguội mẫu trong bình hút ẩm, đem cân xác định khối lƣợng bằng cân phân tích.
Cân 5 g mẫu đƣợc nghiền nhỏ cho vào cốc sứ.
Đem cốc chứa mẫu sấy ở nhiệt độ 105 oC đến khi khối lƣợng cốc không đổi, thƣờng tối thiểu là 6 giờ.
Sau khi sấy xong, đem làm nguội mẫu trong bình hút ẩm, đem cân xác định khối lƣợng. Tiếp tục sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 30 phút rồi để nguội ở bình hút ẩm, cân xác định khối lƣợng bằng cân phân tích. Tiếp tục tiến hành tƣơng tự cho đến khi kết quả 2 lần sấy và cân liên tiếp không đƣợc cách nhau quá 0,5 mg cho một mẫu thử.
Tính kết quả theo công thức.
m G G X ( 1 2)100
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Trong đó
X: Hàm lƣợng nƣớc trong mẫu (%)
G1: Khối lƣợng cốc và mẫu trƣớc khi sấy (g) G2: Khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g) m: Khối lƣợng nguyên liệu (g)
Sai lệch kết quả giữa 2 lần sấy không đƣợc lớn hơn 0,5 %. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả hai lần sấy.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
PHỤ LỤC B
KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU
1. Kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột bằng phƣơng pháp đo đƣờng kính vòng thủy phân.
Bảng ii Kết quả thống kê ANOVA cho đƣờng kính vòng thủy phân theo các dòng nấm mốc. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 370.27 27 13.7137 195.91 0.0000 Within groups 3.92 56 0.07
Total 374.19 83
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Method: 95.0 percent LSD
DONG NAM MOC Count Mean Homogeneous Groups
M4.4 3 0 X M3.5 3 1.16667 X M1.2 3 1.76667 X M3.7 3 1.9 X M2.5 3 2.13333 XX M3.3 3 2.5 XX M1.5 3 2.66667 XX M4.1 3 2.7 XXX M2.3 3 2.76667 XXX M4.7 3 2.83333 XXXX M1.3 3 2.86667 XXXX M3.2 3 2.96667 XXX M2.2 3 3.03333 XXX M1.4 3 3.06667 XXX M4.3 3 3.1 XX M2.1 3 3.23333 X M4.6 3 4.93333 X M3.1 3 5.36667 X M2.7 3 5.43333 XX M2.6 3 5.5 XX M2.4 3 5.63333 XXX M1.7 3 5.7 XXX M3.4 3 5.7 XXX M1.6 3 5.8 XX M3.6 3 6 X M4.5 3 7.9 X