Các phƣơng pháp bảo quản

2.6.2.1 Cấy truyền định kì

Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản. Các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng ống thạch nghiêng và trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này đƣợc chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này đƣợc lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn đƣợc chuyển đến môi trƣờng mới trƣớc khi già và chết. Phƣơng pháp này là phƣơng pháp khá phổ biến trong nghiên cứu, tuy nhiên vẫn còn nhiều nhƣợc điểm:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc.

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trƣờng cấy không thích hợp.

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.

- Tốn nhiều công sức khi cấy truyền.

2.6.2.2 Giữ giống ở lớp dầu khoáng

Lớp paraffin sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxy không khí và hạn chế sự thoát hơi nƣớc của môi trƣờng thạch nên nồng độ các chất hòa tan không thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật. Vì vậy giống có thể đƣợc bảo quản lâu hơn, không bị nhiễm, không bị thoái hóa.

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

2.6.2.3 Phương pháp lạnh sâu

Phƣơng pháp lạnh sâu dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu, đây là phƣơng pháp đang sử dụng rộng rãi để giữ giống vi sinh vật (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011). Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh, làm tan mẫu, việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể đá trong tế bào.

2.6.2.4 Phương pháp đông khô

Nguyên tắc của phƣơng pháp làm thăng hoa phần nƣớc có trong môi trƣờng nhũ hóa vi sinh vật ở điều kiện chân không (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011). Đây là phƣơng pháp bảo quản phổ biến có hiệu quả cao cho các vi sinh vật khác nhau, tuy nhiên nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau, các chủng giống trƣớc khi đem ra sử dụng phải đƣợc hoạt hóa trong môi trƣờng thích hợp một lần để phục hồi các đặc tính sinh học.

2.6.2.5 Phương pháp sấy chân không

Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dùng nhiệt độ sấy khô nguyên liệu, kết hợp sử dụng bơm chân không để hút không khí và hút ẩm trong nguyên liệu đến độ ẩm theo yêu cầu (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011).

2.6.2.6 Phương pháp sấy thông thường

Phƣơng pháp này là phƣơng pháp dùng để sấy bánh men, vừa đơn giản, dễ tìm vừa không tốn kém nhƣ các phƣơng pháp khác. Chủng vi sinh vật thuần từ ống giống đƣợc đem nhân giống trong môi trƣờng dinh dƣỡng (bột gạo) vô trùng, nuôi cấy ở phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ số lƣợng giống. Sau đó dùng nhiệt độ sấy khô nguyên liệu đến độ ẩm theo yêu cầu. Bánh men là môi trƣờng giữ giống vi sinh vật, duy trì sự sống nhƣng không tạo ƣu thế sinh sản.

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Phƣơng tiện nguyên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.

Địa điểm tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.

3.1.2 Nguyên vật liệu

- Bánh men: Hải Quang Anh, Nếp Thơm, Kim Sƣơng, men Sachi, - Gạo

- Khoai tây

- Tám vò thuốc bắc: Nhục đầu khấu, tế tân, cam thảo, thảo quả, tiêu hồi, bạc hà, bạch truật, nhục quế.

3.1.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.

3.1.3.1 Hóa chất

Agar, D-glucose, CaSO4, MgSO4, KH2PO4, (NH4)2SO4

3.1.3.2 Thiết bị

- Tủ ủ vi sinh (INCUBATOR MIR-262, JAPAN) - Kính hiển vi (ALPHAPHOT-2, YS2, JAPAN)

- Máy ly tâm (HETTICH-ZENTRIFLIGEN, 4810, GERMANY) - pH kế (MARTI NIMI 151, ROMANIA, EU)

- Máy xác định ẩm nhanh (AND MX-50, JAPAN) - Tủ sấy (AAH15035K, KOREA)

- Chiết quang kế (ATAGO, JAPAN)

3.1.3.3 Dụng cụ

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

3.2 Phƣơng pháp nguyên cứu 3.2.1 Chọn loại bánh men 3.2.1 Chọn loại bánh men

Có 4 loại men rƣợu đƣợc mua từ các cơ sở kinh doanh.

Bảng 3.1 Các loại bánh men thƣơng mại dùng để phân lập nấm mốc

Tên loại men Kí hiệu Nguồn gốc xuất xứ

Hải Quang Anh M1 75/50, ấp 3, xã Thới Thƣợng, Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh.

Nếp Thơm M2 Cơ sở Tân Phát, ấp Đông Hậu, xã

Đông Bình, Bình Minh, Vĩnh Long.

Kim Sƣơng M3 Long Xuyên, An Giang.

Sachi M4 74 Quyết Tiến, Tp.Pleiku Gia Lai.

3.2.2 Phƣơng pháp phân tích

- Ứng dụng phƣơng pháp phân lập vi sinh vật để chọn đƣợc giống nấm mốc thuần chủng (xem ở phần phụ lục).

- Thể tích dịch rỉ thu đƣợc bằng cách cho khối cơm sau khi ủ qua máy ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC, dịch rỉ sinh ra đƣợc xác định bằng ống đong 50ml.

- Độ Brix của dịch rỉ đƣợc xác định bằng chiết quang kế (032 oBrix) và thực hiện ở nhiệt độ phòng.

- Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ tạo thành đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Lane- Eynon (xem ở phần mục lục).

- Lƣợng đƣờng sinh ra đƣợc xác định bằng thể tích dịch rỉ  hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ.

3.2.3 Phân tích dữ liệu

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 hoặc 3 lần lặp lại. Kết quả thu nhận đƣợc phân tích thống kê bằng chƣơng trình Statgraphics centurion XV.

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

3.2.4 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn sơ bộ nấm mốc từ bánh men

3.2.4.1 Thí nghiệm 1.1: Phân lập nấm mốc từ bánh men

- Mục đích

Phân lập đƣợc các dòng nấm mốc thuần chủng từ các loại bánh men để tiến hành khảo sát những hoạt tính đƣờng hóa của nấm mốc thuần chủng.

- Bố trí thí nghiệm

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm mốc

- Nội dung thí nghiệm

Phân lập nấm mốc bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối gạo đƣợc làm nguội đến

Gạo (20 g)

Nuôi nấm mốc Để nguội Xử lý sơ bộ

Ủ (30 oC, 3 ngày)

Cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng PGA

Trữ giống Nấu chín

Ủ (30 o

C, 2448 h)

Giống mốc thuần Kiểm tra độ thuần khiết

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

nhiệt độ 3540 oC và cho 1 % bánh men vào, trộn đều, tạo khoảng trống giữa khối gạo nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc. Dùng que cấy lấy bào tử nấm mốc trong bình tam giác cho lên đĩa petri có sẵn môi trƣờng PGA. Những đĩa petri có chứa bào tử nấm mốc đƣợc ủ ở nhiệt độ 30 o

C trong 3 ngày. Thao tác đƣợc lặp lại nhiều lần để thu đƣợc giống nấm mốc thuần chủng và trữ giống trong môi trƣờng thạch nghiêng.

3.2.4.2 Thí nghiệm 1.2: Kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột của nấm mốc vừa phân lập.

Môi trƣờng thạch tinh bột gồm: bột gạo 0,5 % (w/v), pepton 0,1 % (w/v) và agar 1,2% (w/v). Dùng que cấy lấy bào tử nấm mốc thuần đặt vào trung tâm đĩa môi trƣờng thạch tinh bột và ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 24 h. Cho dung dịch iodine 0,25 % lên trên đĩa môi trƣờng nuôi cấy. Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột. Sự mất màu xanh đặc trƣng của phức tinh bột với iodine cho biết đƣợc mức độ thủy phân tinh bột của enzyme do nấm mốc sinh ra.

3.2.5 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn những nấm mốc có khả năng sinh enzyme đƣờng hóa cao. đƣờng hóa cao.

- Mục đích

Từ các dòng nấm mốc thuần chủng đã đƣợc phân lập, tuyển chọn dòng có hoạt lực đƣờng hóa tinh bột cao nhất.

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Bố trí thí nghiệm

Hình 3.2 Sơ đồ tuyển chọn những nấm mốc có khả năng sinh enzyme đƣờng hóa cao.

- Nội dung thí nghiệm

Xác định khả năng đƣờng hóa bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100 ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối cơm đƣợc làm nguội đến nhiệt độ 3540 oC. Huyền phù nấm mốc (bào tử nấm mốc khoảng 105

cfu/ môi trƣờng) đƣợc cho vào khối cơm và trộn đều, tạo khoảng trống giữa các hạt cơm, nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc và ủ ở 30 o

C trong 3 ngày. Dịch đƣờng sinh ra đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4 o C. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra. Xác định khả năng đƣờng hóa của nấm mốc Gạo Xử lý sơ bộ Hấp chín Để nguội Nuôi nấm mốc Ủ (30 oC,3 ngày) Mốc thuần

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

3.2.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tám vò thuốc bắc đến khả năng đƣờng hóa của bột mốc khô. đƣờng hóa của bột mốc khô.

- Mục đích

Nhằm xác định loại thuốc bắc làm tăng hoạt lực đƣờng hóa tinh bột.

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo hoạch định Plackett-Burman với 8 nhân tố là loại thuốc bắc và 2 lần lặp lại.

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm theo Plackett-Burman Lặp lại Nhục đầu khấu (g) Bạch truật (g) Nhục quế (g) Thảo quả (g) Cam thảo (g) Bạc hà (g) Tế tân (g) Tiêu hồi (g) 1 3 0 2 0 0 0 3 3 1 0 2 2 3 0 2 3 0 1 3 0 2 3 0 2 0 0 1 0 2 2 0 3 0 0 0 1 0 0 0 3 3 2 0 3 1 3 2 0 3 3 0 3 0 1 3 2 2 0 3 2 0 3 1 3 2 0 3 0 0 0 3 1 0 0 2 3 3 0 3 3 1 3 0 0 0 3 2 3 0 1 0 2 0 0 0 2 3 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 2 0 0 0 3 3 2 0 2 2 3 0 2 3 0 2 3 0 2 3 0 2 0 0 2 0 2 2 0 3 0 0 0 2 0 0 0 3 3 2 0 3 2 3 2 0 3 3 0 3 0 2 3 2 2 0 3 2 0 3 2 3 2 0 3 0 0 0 3 2 0 0 2 3 3 0 3 3 2 3 0 0 0 3 2 3 0 2 0 2 0 0 0 2 3 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Sơ đồ thí nghiệm

Hình 3.3 Quy trình thử nghiệm làm bột mốc thuần chủng Gạo Xử lý sơ bộ Ngâm (3-4 giờ, ở nhiệt độ phòng) Để ráo Nghiền mịn Tiệt trùng (121 oC, 15 phút) Để nguội Thuốc bắc Tỉ lệ 1:10 Sấy Bánh men Ủ (30 oC, 3 ngày) Cấy giống Huyền phù bào tử nấm mốc Phối trộn

Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Tiến hành thí nghiệm:

Bột gạo đƣợc nghiền mịn cho vào bình tam giác 100 ml và phối trộn với thuốc bắc với tỉ lệ 1:10. Mỗi bình tam giác 100 ml chứa 10 g bột gạo và 1 g thuốc bắc. Thuốc bắc phải đƣợc nghiền mịn trƣớc khi cho vào bột gạo. Độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh khoảng 55-60 %. Môi trƣờng sau khi tiệt trùng để nguội 35-40 o

C và cho chủng dịch huyền phù bào tử nấm mốc đã chuẩn bị vào, trộn đều, đậy nút gòn và giấy bạc. Môi trƣờng bột gạo đƣợc ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 3 ngày. Mật số bào tử nấm mốc chủng vào là 105 cfu/ môi trƣờng. Khối mốc sau khi ủ đƣợc sấy ở nhiệt độ (45 oC  1 oC) và độ ẩm xác định (10 %). Sau đó khối bột đƣợc xay nhỏ thành dạng bột.

Khảo sát khả năng đƣờng hóa của bột mốc bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100 ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối cơm đƣợc làm nguội đến nhiệt độ 3540 oC. Cho 2 g bột mốc vào khối cơm, trộn đều, tạo khoảng trống giữa các hạt cơm, nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc và ủ ở 30 oC trong 3 ngày. Dịch đƣờng sinh ra đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4 o C. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra.

3.2.7 Thí nghiệm 4: Khảo sát hàm lƣợng thích hợp của loại thuốc bắc tối ƣu đến hoạt lực đƣờng hóa của bột mốc. đến hoạt lực đƣờng hóa của bột mốc.

- Mục đích

Xác định hàm lƣợng của loại thuốc bắc hữu ích cho quá trình tổng hợp enzyme amylase và hoạt lực đƣờng hóa tinh bột.

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A (hàm lƣợng của thuốc bắc ):

A1: 1,5 g A2: 3 g A3: 4,5 g

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Sơ đồ thí nghiệm

Hình 3.4 Quy trình thử nghiệm làm thuốc bắc thuần với một loại thuốc bắc Gạo Xử lý sơ bộ Ngâm (3-4 giờ, ở nhiệt độ phòng) Để ráo Nghiền mịn Tiệt trùng (121 oC, 15 phút) Để nguội A Sấy Bánh men Ủ (30 oC, 3 ngày) Cấy giống Huyền phù bào tử nấm mốc Phối trộn

Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa A2 A3

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí với một loại thuốc bắc tối ƣu vào 10 g bột gạo trong quá trình sản xuất bột mốc, sau đó kiểm tra hoạt tính đƣờng hóa của bột mốc này. Nhân tố khảo sát là hàm lƣợng của loại thuốc bắc này (1,5 g ; 3 g ; 4,5 g) ảnh hƣởng đến khả năng đƣờng hóa tinh bột của bột mốc.

- Chỉ tiêu đánh giá

+ Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ

+ Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra.

3.2.8 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm và nhiệt độ sấy đến hoạt tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc. tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc.

- Mục đích

Xác định đƣợc nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy thích hợp nhằm giữ đƣợc hoạt tính đƣờng hóa tinh bột cao nhất của bột mốc thuần.

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố B (nhiệt độ sấy):

B1: 40 oC B2: 45 oC B3: 50 oC

Nhân tố C (độ ẩm sau sấy): C1: 8 % C2: 10 % C3: 12 % Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm Nhân tố C Nhân tố B B1 B2 B3 C1 B1 C1 B2 C1 B3 C1 C2 B1 C2 B2 C2 B3 C2 C3 B1 C3 B2 C3 B3 C3

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

- Sơ đồ thí nghiệm

Hình 3.5 Thí nghiệm ảnh hƣởng của độ ẩm và nhiệt độ sấy đến hoạt lực đƣờng hóa

-Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ hình 3.5, nhân tố khảo sát là nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy. Sau khi ủ, khối bột mốc đƣợc sấy lần lƣợt ở các nhiệt độ 40 o

C, 45 oC, 50 oC (1 oC) đến độ ẩm 8 %, 10 %, 12 % nhƣ bảng bố trí thí nghiệm trên. Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy đến khả năng đƣờng hóa tinh bột của bột mốc. Đồng thời xác định nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy tốt nhất cho bảo quản. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra. Gạo …… Ủ (30 oC, 3 ngày) Sấy Bánh men

Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa

B C

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

3.2.9 Thí nghiệm 6: Theo dõi thời gian bảo quản bột mốc đến hoạt lực đƣờng hóa tinh bột. hóa tinh bột.

- Mục đích

Nhằm kiểm tra hoạt tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc trong thời gian bảo quản khác nhau.

- Bố trí thí nghiệm

Để kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa tinh bột của bột mốc, thí nghiệm đƣợc khảo sát ở các mốc thời gian khác nhau: 0, 7, 14, 28 ngày

- Tiến hành thí nghiệm

Sau khi xác định nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy tối ƣu cho quá trình đƣờng hóa của bột mốc, tiến hành cho bột mốc vào bao bì PE và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khảo sát hoạt tính đƣờng hóa của bột nấm mốc theo thời gian bảo quản khác nhau.