3.2.1 Chọn loại bánh men
Có 4 loại men rƣợu đƣợc mua từ các cơ sở kinh doanh.
Bảng 3.1 Các loại bánh men thƣơng mại dùng để phân lập nấm mốc
Tên loại men Kí hiệu Nguồn gốc xuất xứ
Hải Quang Anh M1 75/50, ấp 3, xã Thới Thƣợng, Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh.
Nếp Thơm M2 Cơ sở Tân Phát, ấp Đông Hậu, xã
Đông Bình, Bình Minh, Vĩnh Long.
Kim Sƣơng M3 Long Xuyên, An Giang.
Sachi M4 74 Quyết Tiến, Tp.Pleiku Gia Lai.
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích
- Ứng dụng phƣơng pháp phân lập vi sinh vật để chọn đƣợc giống nấm mốc thuần chủng (xem ở phần phụ lục).
- Thể tích dịch rỉ thu đƣợc bằng cách cho khối cơm sau khi ủ qua máy ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC, dịch rỉ sinh ra đƣợc xác định bằng ống đong 50ml.
- Độ Brix của dịch rỉ đƣợc xác định bằng chiết quang kế (032 oBrix) và thực hiện ở nhiệt độ phòng.
- Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ tạo thành đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Lane- Eynon (xem ở phần mục lục).
- Lƣợng đƣờng sinh ra đƣợc xác định bằng thể tích dịch rỉ hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ.
3.2.3 Phân tích dữ liệu
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 hoặc 3 lần lặp lại. Kết quả thu nhận đƣợc phân tích thống kê bằng chƣơng trình Statgraphics centurion XV.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
3.2.4 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn sơ bộ nấm mốc từ bánh men
3.2.4.1 Thí nghiệm 1.1: Phân lập nấm mốc từ bánh men
- Mục đích
Phân lập đƣợc các dòng nấm mốc thuần chủng từ các loại bánh men để tiến hành khảo sát những hoạt tính đƣờng hóa của nấm mốc thuần chủng.
- Bố trí thí nghiệm
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm mốc
- Nội dung thí nghiệm
Phân lập nấm mốc bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối gạo đƣợc làm nguội đến
Gạo (20 g)
Nuôi nấm mốc Để nguội Xử lý sơ bộ
Ủ (30 oC, 3 ngày)
Cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng PGA
Trữ giống Nấu chín
Ủ (30 o
C, 2448 h)
Giống mốc thuần Kiểm tra độ thuần khiết
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
nhiệt độ 3540 oC và cho 1 % bánh men vào, trộn đều, tạo khoảng trống giữa khối gạo nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc. Dùng que cấy lấy bào tử nấm mốc trong bình tam giác cho lên đĩa petri có sẵn môi trƣờng PGA. Những đĩa petri có chứa bào tử nấm mốc đƣợc ủ ở nhiệt độ 30 o
C trong 3 ngày. Thao tác đƣợc lặp lại nhiều lần để thu đƣợc giống nấm mốc thuần chủng và trữ giống trong môi trƣờng thạch nghiêng.
3.2.4.2 Thí nghiệm 1.2: Kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột của nấm mốc vừa phân lập.
Môi trƣờng thạch tinh bột gồm: bột gạo 0,5 % (w/v), pepton 0,1 % (w/v) và agar 1,2% (w/v). Dùng que cấy lấy bào tử nấm mốc thuần đặt vào trung tâm đĩa môi trƣờng thạch tinh bột và ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 24 h. Cho dung dịch iodine 0,25 % lên trên đĩa môi trƣờng nuôi cấy. Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột. Sự mất màu xanh đặc trƣng của phức tinh bột với iodine cho biết đƣợc mức độ thủy phân tinh bột của enzyme do nấm mốc sinh ra.
3.2.5 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn những nấm mốc có khả năng sinh enzyme đƣờng hóa cao. đƣờng hóa cao.
- Mục đích
Từ các dòng nấm mốc thuần chủng đã đƣợc phân lập, tuyển chọn dòng có hoạt lực đƣờng hóa tinh bột cao nhất.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Bố trí thí nghiệm
Hình 3.2 Sơ đồ tuyển chọn những nấm mốc có khả năng sinh enzyme đƣờng hóa cao.
- Nội dung thí nghiệm
Xác định khả năng đƣờng hóa bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100 ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối cơm đƣợc làm nguội đến nhiệt độ 3540 oC. Huyền phù nấm mốc (bào tử nấm mốc khoảng 105
cfu/ môi trƣờng) đƣợc cho vào khối cơm và trộn đều, tạo khoảng trống giữa các hạt cơm, nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc và ủ ở 30 o
C trong 3 ngày. Dịch đƣờng sinh ra đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4 o C. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra. Xác định khả năng đƣờng hóa của nấm mốc Gạo Xử lý sơ bộ Hấp chín Để nguội Nuôi nấm mốc Ủ (30 oC,3 ngày) Mốc thuần
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
3.2.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tám vò thuốc bắc đến khả năng đƣờng hóa của bột mốc khô. đƣờng hóa của bột mốc khô.
- Mục đích
Nhằm xác định loại thuốc bắc làm tăng hoạt lực đƣờng hóa tinh bột.
- Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí theo hoạch định Plackett-Burman với 8 nhân tố là loại thuốc bắc và 2 lần lặp lại.
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm theo Plackett-Burman Lặp lại Nhục đầu khấu (g) Bạch truật (g) Nhục quế (g) Thảo quả (g) Cam thảo (g) Bạc hà (g) Tế tân (g) Tiêu hồi (g) 1 3 0 2 0 0 0 3 3 1 0 2 2 3 0 2 3 0 1 3 0 2 3 0 2 0 0 1 0 2 2 0 3 0 0 0 1 0 0 0 3 3 2 0 3 1 3 2 0 3 3 0 3 0 1 3 2 2 0 3 2 0 3 1 3 2 0 3 0 0 0 3 1 0 0 2 3 3 0 3 3 1 3 0 0 0 3 2 3 0 1 0 2 0 0 0 2 3 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 2 0 0 0 3 3 2 0 2 2 3 0 2 3 0 2 3 0 2 3 0 2 0 0 2 0 2 2 0 3 0 0 0 2 0 0 0 3 3 2 0 3 2 3 2 0 3 3 0 3 0 2 3 2 2 0 3 2 0 3 2 3 2 0 3 0 0 0 3 2 0 0 2 3 3 0 3 3 2 3 0 0 0 3 2 3 0 2 0 2 0 0 0 2 3 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Sơ đồ thí nghiệm
Hình 3.3 Quy trình thử nghiệm làm bột mốc thuần chủng Gạo Xử lý sơ bộ Ngâm (3-4 giờ, ở nhiệt độ phòng) Để ráo Nghiền mịn Tiệt trùng (121 oC, 15 phút) Để nguội Thuốc bắc Tỉ lệ 1:10 Sấy Bánh men Ủ (30 oC, 3 ngày) Cấy giống Huyền phù bào tử nấm mốc Phối trộn
Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Tiến hành thí nghiệm:
Bột gạo đƣợc nghiền mịn cho vào bình tam giác 100 ml và phối trộn với thuốc bắc với tỉ lệ 1:10. Mỗi bình tam giác 100 ml chứa 10 g bột gạo và 1 g thuốc bắc. Thuốc bắc phải đƣợc nghiền mịn trƣớc khi cho vào bột gạo. Độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh khoảng 55-60 %. Môi trƣờng sau khi tiệt trùng để nguội 35-40 o
C và cho chủng dịch huyền phù bào tử nấm mốc đã chuẩn bị vào, trộn đều, đậy nút gòn và giấy bạc. Môi trƣờng bột gạo đƣợc ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 3 ngày. Mật số bào tử nấm mốc chủng vào là 105 cfu/ môi trƣờng. Khối mốc sau khi ủ đƣợc sấy ở nhiệt độ (45 oC 1 oC) và độ ẩm xác định (10 %). Sau đó khối bột đƣợc xay nhỏ thành dạng bột.
Khảo sát khả năng đƣờng hóa của bột mốc bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác 100 ml, đậy bằng nút gòn và giấy bạc, ngâm trong thời gian 3-4 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạo đƣơc hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 1 giờ. Khối cơm đƣợc làm nguội đến nhiệt độ 3540 oC. Cho 2 g bột mốc vào khối cơm, trộn đều, tạo khoảng trống giữa các hạt cơm, nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc và ủ ở 30 oC trong 3 ngày. Dịch đƣờng sinh ra đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4 o C. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra.
3.2.7 Thí nghiệm 4: Khảo sát hàm lƣợng thích hợp của loại thuốc bắc tối ƣu đến hoạt lực đƣờng hóa của bột mốc. đến hoạt lực đƣờng hóa của bột mốc.
- Mục đích
Xác định hàm lƣợng của loại thuốc bắc hữu ích cho quá trình tổng hợp enzyme amylase và hoạt lực đƣờng hóa tinh bột.
- Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A (hàm lƣợng của thuốc bắc ):
A1: 1,5 g A2: 3 g A3: 4,5 g
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Sơ đồ thí nghiệm
Hình 3.4 Quy trình thử nghiệm làm thuốc bắc thuần với một loại thuốc bắc Gạo Xử lý sơ bộ Ngâm (3-4 giờ, ở nhiệt độ phòng) Để ráo Nghiền mịn Tiệt trùng (121 oC, 15 phút) Để nguội A Sấy Bánh men Ủ (30 oC, 3 ngày) Cấy giống Huyền phù bào tử nấm mốc Phối trộn
Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa A2 A3
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí với một loại thuốc bắc tối ƣu vào 10 g bột gạo trong quá trình sản xuất bột mốc, sau đó kiểm tra hoạt tính đƣờng hóa của bột mốc này. Nhân tố khảo sát là hàm lƣợng của loại thuốc bắc này (1,5 g ; 3 g ; 4,5 g) ảnh hƣởng đến khả năng đƣờng hóa tinh bột của bột mốc.
- Chỉ tiêu đánh giá
+ Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ
+ Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra.
3.2.8 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm và nhiệt độ sấy đến hoạt tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc. tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc.
- Mục đích
Xác định đƣợc nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy thích hợp nhằm giữ đƣợc hoạt tính đƣờng hóa tinh bột cao nhất của bột mốc thuần.
- Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố B (nhiệt độ sấy):
B1: 40 oC B2: 45 oC B3: 50 oC
Nhân tố C (độ ẩm sau sấy): C1: 8 % C2: 10 % C3: 12 % Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm Nhân tố C Nhân tố B B1 B2 B3 C1 B1 C1 B2 C1 B3 C1 C2 B1 C2 B2 C2 B3 C2 C3 B1 C3 B2 C3 B3 C3
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
- Sơ đồ thí nghiệm
Hình 3.5 Thí nghiệm ảnh hƣởng của độ ẩm và nhiệt độ sấy đến hoạt lực đƣờng hóa
-Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ hình 3.5, nhân tố khảo sát là nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy. Sau khi ủ, khối bột mốc đƣợc sấy lần lƣợt ở các nhiệt độ 40 o
C, 45 oC, 50 oC (1 oC) đến độ ẩm 8 %, 10 %, 12 % nhƣ bảng bố trí thí nghiệm trên. Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy đến khả năng đƣờng hóa tinh bột của bột mốc. Đồng thời xác định nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy tốt nhất cho bảo quản. - Chỉ tiêu đánh giá + Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ + Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra. Gạo …… Ủ (30 oC, 3 ngày) Sấy Bánh men
Kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa
B C
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
3.2.9 Thí nghiệm 6: Theo dõi thời gian bảo quản bột mốc đến hoạt lực đƣờng hóa tinh bột. hóa tinh bột.
- Mục đích
Nhằm kiểm tra hoạt tính đƣờng hóa tinh bột của bột mốc trong thời gian bảo quản khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm
Để kiểm tra hoạt lực đƣờng hóa tinh bột của bột mốc, thí nghiệm đƣợc khảo sát ở các mốc thời gian khác nhau: 0, 7, 14, 28 ngày
- Tiến hành thí nghiệm
Sau khi xác định nhiệt độ sấy và độ ẩm sau khi sấy tối ƣu cho quá trình đƣờng hóa của bột mốc, tiến hành cho bột mốc vào bao bì PE và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khảo sát hoạt tính đƣờng hóa của bột nấm mốc theo thời gian bảo quản khác nhau.
- Chỉ tiêu đánh giá
+ Thể tích dịch rỉ. + Độ Brix dịch rỉ
+ Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ. + Lƣợng đƣờng sinh ra.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các dòng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột cao. tinh bột cao.
Giống vi sinh vật thuần chủng và tốt cho quá trình lên men rƣợu là yếu tố rất quan trọng và có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất rƣợu công nghiệp. Các giống vi sinh vật đƣợc phân lập và tuyển chọn từ các nguồn khác nhau. Kết quả đã phân lập đƣợc 28 dòng nấm mốc thuần từ 4 loại bánh men thị trƣờng và đặc điểm của các dòng nấm mốc đƣợc thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc thuần đã đƣợc phân lập
STT Dòng nấm mốc Đặc điểm của các dòng nấm mốc
1 M1.1 Khuẩn ty rất phát triển, có màu trắng, rất dày. Bào tử có màu xám đen.
2 M1.2 Khuẩn ty màu trắng, ít phát triển, có độ dày trung bình, trên mặt đĩa tạo thành khối bông. 3 M1.3 Khuẩn ty phát triển rất ít. Bào tử là những hạt li
ti màu đen xuất hiện trên đầu sợi khuẩn ty 4 M1.4 Khuẩn ty phát triển rất ít, có màu trắng. Bào tử
màu xanh lục.
5 M1.5 Khuẩn ty có màu trắng, có độ cao và độ dày trung bình. Sau 2 ngày ủ, khuẩn ty chuyển sang màu xám nâu. Bào tử là những hạt li ti màu nâu trên sợi những khuẩn ty
6 M1.6 Khuẩn ty rất ít phát triển, nằm sát mặt đĩa. Bào tử có màu đen.
7 M1.7 Khuẩn ty màu trắng, rất phát triển, nhƣng rất thấp. Sau 2 ngày ủ lan rộng khắp đĩa. Bào tử là những hạt li ti màu xám,
8 M2.1 Khuẩn ty phát triển rất ít, nằm sát mặt đĩa. Sau 2 ngày khuẩn ty từ màu trắng chuyển sang màu xám đen. Bào tử màu xám.
9 M2.2 Khuẩn ty màu trắng, phát triển rất ít. Bào tử có màu nâu đen.
10 M2.3 Khuẩn ty màu trắng, phát triển ít, rất thƣa, nằm sát mặt đĩa. Bào tử màu đen nhạt.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
11 M2.4 Khuẩn ty phát triển rất ít có màu trắng xám. Bào tử có màu nâu đen.
12 M2.5 Khuẩn ty màu trắng và rất ít. Bào tử màu xanh lục và có rễ giả màu vàng.
13 M2.6 Khuẩn ty màu trắng rất phát triển. Sau 2 ngày ủ, khuẩn ty xuất hiện màu xám nâu và xuất hiện bào tử. Bào tử là những hạt li ti có màu nâu. 14 M2.7 Khuẩn ty phát triển rất ít, sợi mảnh có màu
vàng nâu. Ở đầu khuẩn ty xuất hiện bào tử màu xám.
15 M3.1 Khuẩn ty màu trắng, rất phát triển, mọc lan nhanh và cao. Bào tử đính xuất hiện trên hệ sợi khuẩn ty có màu vàng nâu.
16 M3.2 Khuẩn ty rất phát triển, từ màu trắng chuyển sang màu vàng nâu và xuất hiện bào tử. Bào tử đính trên những sợi khuẩn ty có màu nâu đậm. 17 M3.3 Khuẩn ty ít, sợi khuẩn ty thấp gần sát mặt đĩa.
Bào tử có màu nâu đen.
18 M3.4 Khuẩn ty ít phát triển. Sau 2 ngày, khuẩn ty tạo thành từng khối màu đen. Khuẩn ty thấp, nằm sát mặt đĩa. Bào tử là những hạt li ti màu đen. 19 M3.5 Khuẩn ty mọc lan nhanh thành những đốm màu
trắng trên bề mặt môi trƣờng. Bào tử có màu xanh vàng ở giữa những sợi khuẩn ty.
20 M3.6 Khuẩn ty rất phát triển và lan nhanh trên bề mặt đĩa. Sợi khuẩn ty có màu trắng. Bào tử đƣợc sinh ra trên hệ sợi khuẩn ty có màu vàng nâu. 21 M3.7 Khuẩn ty phát triển thành lớp màng phủ kín
trên bề mặt đĩa có màu trắng đục. Bào tử là những hạt li ti màu nâu đen và có rễ giả màu vàng.
22 M4.1 Khuẩn ty phát triển rất ít nằm sát mặt đĩa. Bào tử có màu nâu đen.
23 M4.2 Khuẩn ty ít phát triển. Bào tử có màu đen tuyền.
24 M4.3 Khuẩn ty màu trắng phát triển rất mạnh, hệ sợi cao và dày. Bào tử là những hạt li ti màu xám.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
25 M4.4 Khuẩn ty rất phát triển, màu trắng lan rộng