2.5.1 Nguồn Carbon
Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau. Các loại thức ăn carbon có thể dùng làm nguồn năng lƣợng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối với nấm mốc có thể kể đến các loại carbohydrade (monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của carbohydrate, các loại rƣợu, các loại acid hữu cơ, các loại acid amin, protein, lipid…
Trong nhiều trƣờng hợp nếu có mặt trong môi trƣờng và vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một.
Đối với các nguồn carbon phức tạp (tinh bột, cellulose), trƣớc hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa đƣợc chúng.
2.5.2 Nguồn Nitơ
Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn nitơ. Nấm mốc thƣờng có khả năng sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ và các nguồn nitơ vô cơ. Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat. Đôi khi cũng có nhiều loại nấm mốc không phát triển đƣợc trên các môi trƣờng chứa nguồn nitơ là muối amon nhƣng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Sau khi nấm mốc đồng hóa NH4+ trong môi trƣờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO22-, HPO42-, Cl-…) và làm hạ độ pH xuống. Ngƣợc lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý. Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NO3- trong môi trƣờng sẽ tích lũy lại các cation (Na+, K+…) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trƣờng.
Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cƣờng rõ rệt khi bổ sung vào môi trƣờng một ít acid hữu cơ (acid lactic, acid malic…). Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptide, acid amin…).
2.5.3 Các nguyên tố khoáng
Các yếu tố đa lƣợng và vi lƣợng có ảnh hƣởng rất lớn đến sinh trƣởng và tổng hợp enzyme của nấm mốc.
- Ion Mg2+ có ảnh hƣởng tới độ bền nhiệt độ của enzyme. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hƣởng xấu đến sự tổng hợp mọi enzyme bởi nấm sợi, khi đó, sự tổng hợp - amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lƣợng gluco-amylase giảm xuống hàng chục lần (Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004). Nồng độ tối ƣu của MgSO4 sinh tổng hợp - amylase và gluco-amylase là 0,05 % (Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004; Simone et al., 2003; Patel et al., 2005; Ngô Thị Phƣơng Dung và Huỳnh Xuân Phong, 2009). - Phosphorus (P) cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme (adenosine phosphate, thiamine), đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phosphorus ảnh hƣởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do đó làm tăng cƣờng tổng hợp các enzyme amylase. Vì vậy, chúng thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 0,1% KH2PO4 (w/v) (Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004; Simone et al., 2003; Patel et al., 2005; Ngô Thị Phƣơng Dung và Huỳnh Xuân Phong, 2009).
- Một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng cho sự tổng hợp và ổn định -amylase hoạt động là calcium (Ca), vì nó là cấu tử không thể thiếu đƣợc của enzyme này. Calcium còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của proteinase (Hsiu et al., 1964). Muốn tích lũy nhiều -amylase cần có lƣợng calcium trong môi trƣờng từ 0,01-0,05 % (Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004).
Ngoài những nguyên tố đa lƣợng này, cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lƣợng. Chẳng hạn nhƣ cobalt (Co), zinc (Zn)…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme nhƣ: copper (Cu), mercury (Hg)…
2.5.4 Các chất sinh trƣởng
Cũng giống nhƣ các loài vi sinh vật khác, nấm mốc cũng bị ảnh hƣởng bởi các loại vitamin và các chất sinh trƣởng.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Căn cứ vào mối quan hệ của nấm mốc đối với các chất sinh trƣởng mà chúng đƣợc chia thành 2 nhóm:
- Nhóm tự dƣỡng chất sinh trƣởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh trƣởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng.
- Nhóm dị dƣỡng chất sinh trƣởng: cần phải đƣợc cung cấp một vài hoặc nhiều chất sinh trƣởng ở dạng có sẵn.
Nhu cầu về chất sinh trƣởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy tùy theo giống. Phần lớn các vitamin nhóm B đƣợc các loài nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng. Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) đƣợc tìm thấy trong các lớp màng sinh học, sự tồn tại và số lƣợng của các loại vitamin này trong môi trƣờng có ảnh hƣởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với sự hoạt động của các lớp màng này.
2.5.5 Độ ẩm môi trƣờng
Nƣớc là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến quá trình sống của vi sinh vật. Tế bào vi sinh vật có 80 - 90 % H2O, phải có nƣớc thì các chất dinh dƣỡng mới hòa tan và khuyết tán vào tế bào, nếu không có sự sống sẽ không tồn tại (Lê Xuân Phƣơng, 2001). Do đó, độ ẩm là yếu tố quan trọng của môi trƣờng. Trong điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ƣu nằm trong giới hạn 65-70 %, nhƣng thực tế trong sản xuất do điều kiện vô trùng không đạt nhƣ phòng thí nghiệm. Vì độ ẩm cao sẽ làm cho môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật bị nhiễm tạp khuẩn. Ở một số nƣớc trên thế giới, ngƣời ta thƣờng nuôi cấy nấm mốc trên môi trƣờng có độ ẩm tƣơng đối 58-60 %. Ở các nhà máy sản xuất rƣợu nƣớc ta, độ ẩm môi trƣờng thƣờng vào khoảng 50 %, có khi thấp hơn. Độ ẩm môi trƣờng thấp sẽ hạn chế đƣợc sự phát triển của tạp khuẩn, nhƣng nấm mốc phát triển chậm dần đến tích tụ enzyme ít và kéo dài thời gian (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
2.5.6 Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của chúng. Nhiều nhà nguyên cứu cho biết nấm mốc và nấm men có nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển là 28-30 oC, vi khuẩn 34-38 oC (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000). Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, nấm mốc sử dụng khoảng 25-30 % chất khô của môi trƣờng và thải ra một lƣợng nhiệt khá lớn. Ở giai đoạn phát triển mạnh, lƣợng nhiệt môi trƣờng thải ra lên đến 335-377 kcal/kg.h. Do đó, cần phải duy trì và ổn định nhiệt độ môi trƣờng.
Nhiệt độ không khí trƣớc khi đƣa vào phòng nuôi khoảng 22-25 oC và độ ẩm tƣơng đối khoảng 98-100 % (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Tốc độ phản ứng của enzyme cũng nhƣ phần lớn các phản ứng hóa học đều tăng khi nhiệt độ tăng. Tính phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng nhiệt độ đƣợc thể hiện nhƣ sau: 2 ln RT E dT k d (2.1) Trong đó:
T: Nhiệt độ tuyệt đối R: Hằng số khí lý tƣởng K: Hằng số vận tốc phản ứng
E: Năng lƣợng hoạt hóa để thủy phân tinh bột E = 13000-16000 kcal/mol
Mỗi loại enzyme có nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính xúc tác. Nếu vƣợt quá giới hạn này thì chúng sẽ bị biến tính dần và giảm hoạt lực đối với cơ chất.
2.5.7 Thời gian
Thời gian nuôi để có lƣợng amylase cực lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trƣởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Thời gian sinh ra enzyme đƣờng hóa còn tùy thuộc vào từng loài nấm mốc, thông thƣờng sau khi nuôi cấy từ 30-32 giờ thì nấm sợi sẽ phát triển mạnh nhất và sự tạo thành enzyme đƣờng hóa nhiều nhất khi kết thúc sợi nấm bắt đầu sinh bào tử.
2.5.8 pH môi trƣờng
Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động tốt ở trạng thái ion hóa nhất định, trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của môi trƣờng (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp bề mặt, pH môi trƣờng ít ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc, tuy nhiên thực tế pH có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tích tụ enzyme, pH thấp sẽ hạn chế đƣợc sự phát triển của tạp khuẩn nhƣng sẽ ảnh hƣởng đến sự tích tụ enzyme. Do đó, pH thƣờng áp dụng pH tự nhiên của môi trƣờng vào khoảng 5,5-6,0 (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
2.5.9 Lƣợng oxy hòa tan
Ngoài các yếu tố trên, lƣợng oxy cũng ảnh hƣởng rất lớn đến các quá trình lên men diễn ra theo kiểu hiếu khí hay yếm khí và do đó dẫn đến sự hình thành sản phẩm khác nhau (Trần Minh Tâm, 2000).
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, nấm mốc rất cần nhiều năng lƣợng, nguồn năng lƣợng này đƣợc cung cấp bởi các quá trình oxy hóa glucid hoàn toàn hay không hoàn toàn để nấm mốc phát triển và sinh enzyme. Khi nuôi cấy theo phƣơng
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
pháp bề mặt, nấm mốc thƣờng phát triển tốt vì dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí. Vì thế môi trƣờng nuôi cấy phải có độ xốp, thoáng khí giúp nấm mốc phát triển tốt, tạo nhiều sinh khối và enzyme (Nguyễn Đình Thƣởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
2.6 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật
Quá trình bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp vi sinh vật. Việc bảo quản giống không chỉ đơn thuần là giữ những chủng giống trên một vài môi trƣờng dinh dƣỡng thông thƣờng và cấy truyền định kỳ, mà phải đảm bảo khả năng sống sót và giữ đƣợc những đặc tính ban đầu của vi sinh vật. Vì vậy quá trình bảo quản giống vi sinh vật là rất khó khăn.
2.6.1 Mục đích của quá trình bảo quản
Đảm bảo khả năng sống sót và sự ổn định đặc tính di truyền của chủng vi sinh vật, không bị thoái hóa thuận lợi cho quá trình nghiên cứu và sản xuất.
2.6.2 Các phƣơng pháp bảo quản
2.6.2.1 Cấy truyền định kì
Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản. Các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng ống thạch nghiêng và trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này đƣợc chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này đƣợc lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn đƣợc chuyển đến môi trƣờng mới trƣớc khi già và chết. Phƣơng pháp này là phƣơng pháp khá phổ biến trong nghiên cứu, tuy nhiên vẫn còn nhiều nhƣợc điểm:
- Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trƣờng cấy không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
- Tốn nhiều công sức khi cấy truyền.
2.6.2.2 Giữ giống ở lớp dầu khoáng
Lớp paraffin sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxy không khí và hạn chế sự thoát hơi nƣớc của môi trƣờng thạch nên nồng độ các chất hòa tan không thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật. Vì vậy giống có thể đƣợc bảo quản lâu hơn, không bị nhiễm, không bị thoái hóa.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
2.6.2.3 Phương pháp lạnh sâu
Phƣơng pháp lạnh sâu dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu, đây là phƣơng pháp đang sử dụng rộng rãi để giữ giống vi sinh vật (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011). Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh, làm tan mẫu, việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể đá trong tế bào.
2.6.2.4 Phương pháp đông khô
Nguyên tắc của phƣơng pháp làm thăng hoa phần nƣớc có trong môi trƣờng nhũ hóa vi sinh vật ở điều kiện chân không (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011). Đây là phƣơng pháp bảo quản phổ biến có hiệu quả cao cho các vi sinh vật khác nhau, tuy nhiên nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau, các chủng giống trƣớc khi đem ra sử dụng phải đƣợc hoạt hóa trong môi trƣờng thích hợp một lần để phục hồi các đặc tính sinh học.
2.6.2.5 Phương pháp sấy chân không
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dùng nhiệt độ sấy khô nguyên liệu, kết hợp sử dụng bơm chân không để hút không khí và hút ẩm trong nguyên liệu đến độ ẩm theo yêu cầu (Ngô Thị Minh Phƣơng, 2011).
2.6.2.6 Phương pháp sấy thông thường
Phƣơng pháp này là phƣơng pháp dùng để sấy bánh men, vừa đơn giản, dễ tìm vừa không tốn kém nhƣ các phƣơng pháp khác. Chủng vi sinh vật thuần từ ống giống đƣợc đem nhân giống trong môi trƣờng dinh dƣỡng (bột gạo) vô trùng, nuôi cấy ở phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ số lƣợng giống. Sau đó dùng nhiệt độ sấy khô nguyên liệu đến độ ẩm theo yêu cầu. Bánh men là môi trƣờng giữ giống vi sinh vật, duy trì sự sống nhƣng không tạo ƣu thế sinh sản.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Phƣơng tiện nguyên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.
Địa điểm tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Nguyên vật liệu
- Bánh men: Hải Quang Anh, Nếp Thơm, Kim Sƣơng, men Sachi, - Gạo
- Khoai tây
- Tám vò thuốc bắc: Nhục đầu khấu, tế tân, cam thảo, thảo quả, tiêu hồi, bạc hà, bạch truật, nhục quế.
3.1.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.
3.1.3.1 Hóa chất
Agar, D-glucose, CaSO4, MgSO4, KH2PO4, (NH4)2SO4
3.1.3.2 Thiết bị
- Tủ ủ vi sinh (INCUBATOR MIR-262, JAPAN) - Kính hiển vi (ALPHAPHOT-2, YS2, JAPAN)
- Máy ly tâm (HETTICH-ZENTRIFLIGEN, 4810, GERMANY) - pH kế (MARTI NIMI 151, ROMANIA, EU)
- Máy xác định ẩm nhanh (AND MX-50, JAPAN) - Tủ sấy (AAH15035K, KOREA)
- Chiết quang kế (ATAGO, JAPAN)
3.1.3.3 Dụng cụ
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
3.2 Phƣơng pháp nguyên cứu 3.2.1 Chọn loại bánh men 3.2.1 Chọn loại bánh men
Có 4 loại men rƣợu đƣợc mua từ các cơ sở kinh doanh.
Bảng 3.1 Các loại bánh men thƣơng mại dùng để phân lập nấm mốc
Tên loại men Kí hiệu Nguồn gốc xuất xứ
Hải Quang Anh M1 75/50, ấp 3, xã Thới Thƣợng, Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh.
Nếp Thơm M2 Cơ sở Tân Phát, ấp Đông Hậu, xã
Đông Bình, Bình Minh, Vĩnh Long.
Kim Sƣơng M3 Long Xuyên, An Giang.
Sachi M4 74 Quyết Tiến, Tp.Pleiku Gia Lai.
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích
- Ứng dụng phƣơng pháp phân lập vi sinh vật để chọn đƣợc giống nấm mốc thuần chủng (xem ở phần phụ lục).
- Thể tích dịch rỉ thu đƣợc bằng cách cho khối cơm sau khi ủ qua máy ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC, dịch rỉ sinh ra đƣợc xác định bằng ống đong 50ml.
- Độ Brix của dịch rỉ đƣợc xác định bằng chiết quang kế (032 oBrix) và thực hiện ở nhiệt độ phòng.
- Hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ tạo thành đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Lane- Eynon (xem ở phần mục lục).
- Lƣợng đƣờng sinh ra đƣợc xác định bằng thể tích dịch rỉ hàm lƣợng đƣờng khử của dịch rỉ.
3.2.3 Phân tích dữ liệu
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 hoặc 3 lần lặp lại. Kết quả thu nhận đƣợc phân tích thống kê bằng chƣơng trình Statgraphics centurion XV.
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
3.2.4 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn sơ bộ nấm mốc từ bánh men
3.2.4.1 Thí nghiệm 1.1: Phân lập nấm mốc từ bánh men
- Mục đích
Phân lập đƣợc các dòng nấm mốc thuần chủng từ các loại bánh men để tiến hành khảo sát những hoạt tính đƣờng hóa của nấm mốc thuần chủng.
- Bố trí thí nghiệm
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm mốc
- Nội dung thí nghiệm
Phân lập nấm mốc bằng cách cho 20 g gạo và 24 ml nƣớc cất vào bình tam giác