2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu của đề tài
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các dòng khoai tây “bố mẹ”: dòng dại (trn, blb, pnt); giống khoai tây trồng (Atlantic, Delikat), và các con lai soma của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat; trn3G (+) Delikat; pnt2G (+) Delikat; pnt2G (+) Atlantic.
- Các dòng khoai tây lai tạo ra từ phép lai Backcross giữa con lai soma với giống khoai tây trồng làm bố (Bảng 2.1)
Bảng 2.1: Các dòng bố mẹ và con lai BC1 làm vật liệu nghiên cứu STT Nguồn gốc Tổ hợp lai soma
(dòng mẹ) Ký hiệu dòng mẹ Cây bố Ký hiệu dòng lai năm 2013 Số hạt gieo (hạt)
1 2013-Hanoi trn3G (+) Delikat 2195/2 Delikat 13.1302 70 2 2013-Hanoi blb2G (+) Delikat 2283/5 Delikat 13.1303 17 3 2013-Hanoi pnt2G (+) Delikat 2235/1 Delikat 13.1304 32 4 2013-Sapa blb2G (+) Delikat 2281/5 Delikat 13.1306 17 5 2013-Sapa pnt2G (+) Delikat 2195/2 Delikat 13.1310 320 6 2013-Sapa blb2G (+) Delikat 2292/4 Delikat 13.1311 110 7 2013-Sapa trn3G (+) Delikat 851/2 Delikat 13.1314 220 8 2013-Sapa trn3G (+) Delikat 838/11 Delikat 13.1315 500 9 2013-Sapa pnt2G (+) Atlantic 248/1 Atlantic 13.1317 158 10 2013-Sapa blb2G (+) Delikat 2295/1 Delikat 13.1320 6 11 2013-Sapa blb2G (+) Delikat 2283/5 Delikat 13.1322 34
Ghi chú: 2013-Hanoi: hạt lai thu tại Hà Nội năm 2013; 2013-Sapa: hạt lai thu tại Sapa năm 2013; trn3G- Solanum tarnii; blb2G-S. bulbocastanum; pnt2G- S.pinatisectum.
Ký hiệu lai soma : (+)
2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
+Hóa chất dùng để tách chiết DNA (phụ lục 1) + Các bước tách chiết DNA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
+ Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR
+ Thành phần cho phản ứng PCR (phụ lục 2,3) + Hóa chất phân tích hóa sinh (phụ lục 4)
Các dụng cụ và máy móc cần thiết cho các thí nghiệm: Cối sứ, pipet, cân vi lượng, máy điện di, máy PCR, mấy li tâm, máy xung điện…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương của các con lai BC1 ở giai đoạn cây con (seedling).
+ Vật liệu thí nghiệm: Gồm các dòng hạt lai có nguồn gốc Hà Nội và Sapa:
STT Nguồn gốc Ký hiệu dòng lai năm 2013 Số hạt gieo (hạt) 1 2013-Hanoi 13.1302 70 2 2013-Hanoi 13.1303 17 3 2013-Hanoi 13.1304 32 4 2013-Sapa 13.1306 17 5 2013-Sapa 13.1310 320 6 2013-Sapa 13.1311 110 7 2013-Sapa 13.1314 220 8 2013-Sapa 13.1315 500 9 2013-Sapa 13.1317 158 10 2013-Sapa 13.1320 6 11 2013-Sapa 13.1322 34
Tiến hành gieo hạt. Sau khi gieo khoảng 10 ngày (cây có 2 lá thật) thì phun dịch lây nhiễm.
Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, đo đếm giữ lại cây khỏe và loại bỏ
những cây bệnh và đánh giá khả năng kháng bênh mốc sương ở giai đoan seedling.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
2.2.2. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sương của con lai BC1 và các dòng/giống bố mẹ qua lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời.
Vật liệu thí nghiệm gồm: Tên dòng Ký hiệu dòng Các dòng/giống bố mẹ Delikat S.bulbocastanum blb2G S.pinatisectum pnt2G
Con lai soma
blb2G (+) Delikat 2283/5 pnt2G (+) Delikat 2195/2 2235/1 Các con lai BC1 2195/2 (x) Delikat 13.1302 (1 - 11) 2283/5 (x) Delikat 13.1303 (1 - 22) 2235/1 (x) Delikat 13.1304 (1 - 5) Chú thích: (+): Ký hiệu lai soma (X): Ký hiệu lai hữu tính
Trồng các con lai trong nhà kính (bao gồm cả giống đối chứng và các dòng bố mẹ). Tiến hành thu lá đơn khi cây bắt đầu có hoa, lây nhiễm bề mặt sau của lá đơn (1 giọt dịch lây nhiễm 15-10 µl). Tiến hành đánh giá đặc tính kháng nhiễm trên lá khoai tây sau 6-7 ngày lây nhiễm. Đánh giá theo thang điểm từ 1 – 9 (mức 1 tương đương không xuất hiện triệu chứng bệnh, mức 9: diện tích chết hoại, sự phát triển của sợi nấm chiếm 90 – 100% diện tích lá).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
2.2.3. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sương của con lai BC1 và các dòng/giống bố mẹ qua lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ.
Vật liệu thí nghiệm gồm: Tên dòng Ký hiệu dòng Các dòng/giống bố mẹ Delikat S.bulbocastanum blb2G S.pinatisectum pnt2G blb2G (+) Delikat 2283/5 pnt2G (+) Delikat 2195/2 2235/1 Các con lai BC1 2195/2 (x) Delikat 13.1302 (1 - 11) 2283/5 (x) Delikat 13.1303 (1 - 22) 2235/1 (x) Delikat 13.1304 (1 - 5) Chú thích: (+): Ký hiệu lai soma (X): Ký hiệu lai hữu tính
Củ mới được thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củđược bảo quản từ 1 – 2 tháng ở 8 – 90C (bao gồm cả giống đối chứng). Mỗi kiểu gen gồm 5 củ x 2 lát/củ. Nhỏ một giọt dịnh lây nhiễm với thể tích 20 - 30µl lên chính giữa bề mặt lát củ, đưa khay chứa lát cắt củ vào điều kiện lây nhiễm nhân tạo.
Sau 7 – 10 ngày thấy nấm xuất hiện ở bề mặt trên của lát củ và bề mặt sau của lát củ. Đánh giá theo thang điểm từ 1 – 9 (mức 1 tương đương không xuất hiện triệu chứng bệnh, mức 9: diện tích chết hoại, sự phát triển của sợi nấm chiếm 90 – 100% diện tích lát củ).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
2.2.4. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của con lai BC1 và các dòng/giống bố mẹ Vật liệu thí nghiệm: Tên dòng Ký hiệu dòng Các giống bố mẹ Atlantic Delikat S.bulbocastanum blb2G S.tarinil trn3G S.pinatisectum pnt2G Các dòng lai soma blb2G (+) Delikat 2283/5 2281/10 2292/4 pnt2G (+) Delikat 2235/1 2195/2 pnt2G (+) Atlantic 248/1 trn3G (+) Delikat 838/11 Các dòng con lai BC1 2195/2 (x) Delikat 13.1302 (1 - 11) 2283/5 (x) Delikat 13.1303 (1 - 22) 2235/1 (x) Delikat 13.1304 (1 - 5) 2281/10 (x) Delikat 13.1306 (1 – 5) 2195/2 (x) Delikat 13.1310 (1 - 4) 2292/4 (x) Delikat 13.1311 (1 - 3) 838/11 (x) Delikat 13.1315 (1 - 6) 248/1 (x) Atlantic 13.1317 (1 – 7) Chú thích: (+): Ký hiệu lai soma (X): Ký hiệu lai hữu tính
Các cây trồng trong vườn ươm và đồng ruộng được đánh giá các đặc tính sinh trưởng phát triển cũng như năng suất.
Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển, khả năng cho chọn lọc của các con lai BC1 và các dòng/giống bố mẹ.
Đánh giá các yếu tố hình thành năng suất, phẩm chất củ thu được của các con lai BC1 và các dòng/giống bố mẹ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh đánh giá chất lượng củ của các đối tượng thí nghiệm.
2.2.5. Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương ở các thế hệ con lai BC1 bằng chỉ thị phân tử.
Vật liệu thí nghiệm:
- Dòng khoai tây dại S.bulbocastanum - Giống khoai tây trồng Delikat
- Con lai soma của tổ hợp blb2G (+) Delikat/2283/5
- 7 con lai BC1 của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 (x) Delikat
(13.1303.1, 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6, 13.1303.7, 13.1303.11, 13.1303.22)
2.2.6. Đánh giá khả năng tạo con lai thế hệ BC2 từ các con lai BC1 lai trở lại với khoai tây trồng
Các vật liệu được chọn làm các dòng khoai tây của tổ hợp lai blb2G (+)
Delikat/2283/5 (x) Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6, 13.1303.22)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm – (theo Darsow et al, 2004; Hammann et al., 2009)
Bước 1: tạo dịch lây nhiễm ban đầu
- Chuẩn bị phòng nuôi cấy, đĩa petri, hộp gỗ lây nhiễm, dao kéo, giấy thấm, nước cất, pipet...
- Nguồn nấm bệnh được thu từ các cây khoai tây bị bệnh mốc sương tại các vùng trồng khoai tây khác nhau.
- Các lá bệnh sau khi thu thập được nhúng vào nước (lượng nước tùy thuộc vào số lượng lá nhiều hay ít) để thu các bào tử nấm trên bề mặt lá, tạo dịch lây nhiễm ban đầu. Sau khi nhúng tiến hành lọc dung dịch bào tử nấm để tạo dịch lây nhiễm.
- Sau khi có dịch lây nhiễm ban đầu, tiến hành quan sát bào tử nấm trong dịch lây nhiễm trên kính hiển vi, dịch lây nhiễm có mặt bào tử nấm mốc sương
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Bước 2: Lây nhiễm nhân tạo trên các lát cắt củ
Quá trình lây nhiễm trên củ được thực hiện theo quy trình lây nhiễm nhân tạo trên các lát củ - “eucablight protocol – Tuber slice test for tuber blight resistance, Leontine Colon, Bent J. Nielsen and Ulrich Darsow. 2004”
- Củ khoai tây được cắt lát dày khoảng 0,7 – 1cm, làm khô bề mặt lát cắt bằng giấy thấm.
- Xếp các lát củ vào khay gỗ lây nhiễm, lót giấy thấm hoặc các mảnh vải
đã được tưới nước xuống dưới khay gỗđể giữẩm cho các lát củ.
- Nhỏ một giọt dịch lây nhiễm (20 - 30µl) lên lát cắt củ, đậy tấm kính lên khay gỗ và chuyển vào điều kiện lây nhiễm nhân tạo: các lát củ được đặt trong phòng lây nhiễm nhân tạo, yêu cầu điều kiện không có ánh sáng, nhiệt độ 18 – 200C thường xuyên theo dõi độẩm khay lây nhiễm để đảm bảo độ ẩm ở mức 90 – 100% (nếu không đủ độ ẩm tiến hành tưới bổ sung nước lên giấy thấm hoặc tấm vải đặt dưới khay gỗ)
- Một ngày sau lây nhiễm, tiến hành lật đảo các lát cắt củ để đảm bảo chỉ có sợi nấm Phytophthora infestans phát triển ở mặt trên của lát cắt củ.
Bước 3: Quan sát và đánh giá
Sau khi lây nhiễm từ 7 – 9 ngày ta có thể thu bào tử nấm trên bề mặt lát củ, tiến hành đánh giá triệu chứng bệnh trên các lát củ và quan sát đặc điểm hình thái của nấm dưới kính hiển vi điện tử.
2.3.2. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh trên cây con trồng từ hạt lai. (theo Darsow et al, 2004; Hammann et al., 2009)
+ Tạo dung dịch Gibberelic Acid Solution (GA3) để phá ngủ nghỉ hạt khoai tây:
1 g Giberelic Acid powder (tan trong cồn 960) + 1l nước cất = GA3 solution (1g/l)
Lấy 1ml dung dịch trên hòa tan với 1l nước cất ta có dung dịch GA3(1mg/l).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
+ Gieo hạt:
Để hạt trên đĩa petri với giấy lọc, bổ sung GA3 cho đến khi các hạt ngập hoàn toàn trong dung dịch GA3 sau đó để các hạt trong dung dịch qua đêm.
Rửa hạt dưới vòi nước và gieo hạt trên các khay nhựa (35cm x 50cm). Gieo với mật độ khoảng 200 hạt/khay, để dưới ánh sáng ban ngày với nhiệt đọ
180C – 200C.
Sau khi hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật thì tỉa thưa và đem trồng ra các khay mới.
+ Lây bệnh:
Sau khi gieo khoảng 10 ngày (cây có 2 lá thật) thì phun dịch lây nhiễm, phun ướt và đều trên bề mặt lá, phủ nilon hoặc đậy tấm kính để giữ ẩm trong vòng 8h – 12h (lưu ý chỉ tưới nước trước khi lây nhiễm và không tưới sau khi lây nhiễm).
+ Đo bệnh:
Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, giữ lại cây khỏe và loại bỏ những cây bệnh. Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho những cây khỏe sau lây nhiễm, từ lúc này có thể tưới nước.
Tiếp tục chăm sóc cho đến khi thu hoạch củ, mỗi cây giữ lại 1 củ cho vụ
sau. Các củ còn lại tiếp tục đánh giá tính kháng bệnh mốc sương trên củ.
2.3.3. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh mốc sương bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời (Darsow et al, 2004,2008; Hammann et al, 2009)
Bước 1: Chuẩn bị dịch lây nhiễm
Dịch lây nhiễm là dung dịch động bào tử của nấm Phytophthora infestans có mật độ khoảng 5x104động bào tử/ml. Ta có thể chuẩn bị dịch lây nhiễm bằng cách giữ dung dịch túi bào tử có mật độ 3x103 túi bào tử/ml ở nhiệt độ 5 – 120C trong vòng 4 - 5 tiếng trước khi tiến hành lây nhiễm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Lá khoai tây được lấy từ các cành bánh tẻ (cành thứ 3 – 4 tính từ ngọn xuống), chiều rộng của lá từ 3 – 5cm. Dùng kéo sắc để cắt lá, trong quá trình cắt tránh làm tổn thương bề mặt lá.
Đặt vải màn ẩm xuống dưới khay lây nhiễm để giữẩm cho lá. Xếp lá vào khay, mặt dưới của lá xếp lên trên.
Mỗi kiểu gen tiến hành 3 lần lặp, mỗi lần thực hiện trên 5 lá.
Bước 3: Lây nhiễm nhân tạo trên lá
Nhỏ một giọt dịnh lây nhiễm với thể tích 20 - 30µl lên chính giữa bề mặt lá, đưa khay chứa lá vào điều kiện lây nhiễm nhân tạo: chế độ chiếu sáng 12h tối/12h sáng, nhiệt độ phòng lây nhiễm ở mức 18 – 200C, độ ẩm cần đảm bảo ở
mức 90% đến bão hòa.
Sau khi tiến hành nhỏ dịch lây nhiễm 1 ngày, tiến hành lật đảo bề mặt lá (mặt trên của lá hướng lên trên)
Thường xuyên theo dõi độ ẩm của khay lây nhiễm để duy trì độ ẩm từ 90 – 100% (nếu khô quá có thể tưới them nước lên các mảnh vải đặt dưới khay lây nhiễm)
Bước 4: Cho điểm và đánh giá
Tiến hành đánh giá tính kháng bệnh trên lá khoai tây sau 6 – 7 ngày lây nhiễm.
Việc cho điểm dựa trên tỉ lệ diện tích vết chết hoại và sự phát triển của hệ
sợi nấm trên bề mặt lá.
Đánh giá theo thang điểm từ 1 đến 9: Theo tiêu chuẩn nghành (số 32- 1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998). 1. Không thấy vết bệnh 3. Nhiễm nhẹ: < 20% diện tích lá 5. Nhiễm trung bình: 20 – 50% diện tích lá 7. Nhiễm nặng: 51 – 75% diện tích lá 9. Nhiễm rất nặng: >75% diện tích lá
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
2.3.4. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh mốc sương bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Darsow et al, 2004; Hammann et al, 2009)
Bước 1: Chuẩn bị dịch lây nhiễm
Dịch lây nhiễm là dung dịch động bào tử của nấm Phytophthora infestans có mật độ khoảng 5x104động bào tử/ml. Ta có thể chuẩn bị dịch lây nhiễm bằng cách giữ dung dịch túi bào tử có mật độ 3x103 túi bào tử/ml ở nhiệt độ 5 – 120C trong vòng 4 - 5 tiếng trước khi tiến hành lây nhiễm.
Bước 2: chuẩn bị các lát cắt củ
Củ mới được thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củđược bảo quản từ 1 – 2 tháng ở 8 – 90C.
Mỗi kiểu gen gồm 5 củ x 2 lát/củ. Củ khoai tây được cắt lát dày khoảng 0,7 – 1cm, xếp các lát củ vào khay lây nhiễm, lót vải màn đã được làm ẩm.
Bước 3: lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ.
Nhỏ một giọt dịnh lây nhiễm với thể tích 20 - 30µl lên chính giữa bề mặt lát củ, đưa khay chứa lát cắt củ vào điều kiện lây nhiễm nhân tạo: chế độ chiếu sáng 12h tối/12h sáng, nhiệt độ phòng lây nhiễm ở mức 18 – 200C, độ ẩm cần
đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa.
Sau khi tiến hành nhỏ dịch lây nhiễm 1 ngày, tiến hành lật đảo bề mặt lát củ. Thường xuyên theo dõi độ ẩm của khay lây nhiễm để duy trì độ ẩm từ 90 – 100%.
Bước 4: cho điểm và đánh giá
Sau 7 – 10 ngày ta có thể thấy nấm xuất hiện ở bề mặt trên của lát củ và bề mặt sau của lát củ. Tiến hành đánh giá và cho điểm dựa vào hình dạng và tỷ lệ
diện tích vết hoại tử và sự phát triển của hệ sợi nấm.
2.3.5. Phương pháp đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử
Phương pháp đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
bệnh mốc sương nhờ việc sử dụng các cặp mồi liên kết đặc hiệu với các gen kháng.
+ Quy trình tách chiết DNA (theo Tohir Bororov và Ben Budner)
Bước 1: Cân 300mg (khoảng 500 – 600 µl) lá tươi từ cây invitro cho vào cối , nghiền nhuyễn trong buffer (1000 µl ) sau đó ủ trong bể ủ 650C trong vòng 30 phút.
Bước 2: Bổ sung 500µl dung dịch Chlorofom:Izoamyl ethanol, trộn đều
để tạo thành thể nhũ tương sau đó tiến hành li tâm 1 phút ở tốc độ 111500 vòng/phút.Hút 500µl phần dịch tiết trên chuyển sang ống eppendorf mới .
Bước 3: Bổ sung dung dịch 0.1V 10XCTAB buffer và bổ sung dung dịch Chlorofom:Izoamyl ethanol (1:1), sau đó trộn đều để tạo thành thể nhũ tương. Li tâm ở 1 phút ở tốc độ 11500 vòng/phút. Hút 500 µl phần dịch tiết trên chuyển sang ống eppendorf mới .
Bước 4: Bổ sung Isopropanol (tỷ lệ 1:1) lắc đều và giữ trong tủ lạnh sâu - 20oC trong 5 phút. Sau đó li tâm lạnh trong vòng 10 phút ở tốc độ 11500