2.5.5.1. Chuẩn bị môi trường phân lập và nuôi cấy nấm
* Môi trường WA 2% dùng để phân lập nấm bệnh:
- Thành phần môi trường: Agar 20g, nước cất 1000 ml.
- Cách nấu: đổ agar 20g và nước cất cho đủ 1000ml rồi quấy đều cho tan hết
rồi đổ vào bình tam giác sạch, bịt kín bằng giấy bạc. Cho môi trường vào hấp khử
trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C; 1,5 atm trong 30 phút. Để nguội đến 50 – 600C rồi đổ ra đĩa petri đã vô trùng.
* Môi trường PGA (potato – glucose - agar) là môi trường làm thuần nấm bệnh:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
1000ml nước cất.
- Cách nấu: Khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ, đun sôi với 1lít nước
cất, lọc lấy nước trong sau đó thêm vào 20g agar, 20g glucose và nước cất vào cho
đủ 1lít, hoà tan rồi đưa lên bếp đun lại, vừa đun vừa khuấy đều để cho agar không bị vón đến khi sôi lăn tăn sau đó hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C; 1,5 atm trong 30 phút. Để nguội đến 50 – 600C rồi đổ ra đĩa petri đã vô trùng.
2.5.5.2. Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống lạc
- Phương pháp chia mẫu: mẫu hạt giống được chia đều trên mặt phẳng theo
hình tròn. Chia mặt phẳng làm 4 phần đều nhau. Lấy mỗi phần một lượng nhất định sau đó dồn lại sao cho đủ lượng mẫu kiểm tra. Lượng mẫu kiểm tra: 400 hạt.
- Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống bằng phương pháp giấy
thấm của Mathur & Olga Kongsdal năm 2003.
Lấy 400 hạt/mẫu, chia thành 16 phần, mỗi phần 25 hạt
Chuẩn bịđĩa petri và giấy thấm: 16 đĩa/mẫu. Lấy 3 tờ giấy thấm nhúng vào nước cất sao cho ướt đều sau đó đặt vào đĩa petri
Đặt 25 hạt/đĩa petri, thành 3 vòng, vòng ngoài 15 hạt, vòng giữa 9 hạt, 1 hạt
ở tâm của đĩa, khoảng cách giữa các hạt và các vòng bằng nhau.
Viết nhãn lên đĩa petri: tên mẫu, ngày tháng giám định hạt
Ủ hạt ở nhiệt độ 220C trong 7 ngày ở thời gian chiếu sáng là 12 giờ sáng và 12 giờ tối.
Sau 7 ngày tiến hành kiểm tra và giám định nấm dưới kính lúp soi nổi và
kính hiển vi. Soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong theo tâm đĩa. Đánh dấu mốc
kiểm tra và tên nấm bằng chì mầu.
Đối với những nấm chưa xác định rõ thì phải khều được bào tử nấm để soi
dưới kính hiển vi, hoặc cho lên môt trường WA để làm thuần nấm, sau đó chuyển
sang môi trường PGA để quan sát tản nấm.
- Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh, tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ hạt cứng, tỷ lệ hạt thối.
2.5.5.3. Thử nghiệm dịch chiết từ sả trong việc ức chế nấm bệnh hại hạt giống lạc
- Củ sả rửa sạch, đem nghiền nhỏ, chắt lấy dịch, sau đó pha loãng ra thành
các nồng độ (2%, 5%, 10%) tùy theo mục đích sử dụng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 khác nhau trong thời gian 10 phút, sau đó chắt dịch chiết đi, thấm khô hạt qua giấy thấm nước đã được hấp vô trùng, đặt hạt trên giấy thấm.
- Tiến hành thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức là 50 hạt, nhắc lại 3 lần.
+ Công thức 1: đối chứng (không xử lý)
+ Công thức 2: Ngâm hạt trong dịch chiết sả 2% trong khoảng thời gian là
10 phút.
+ Công thức 3: Ngâm hạt trong dịch chiết sả 5% trong khoảng thời gian
là 10 phút
+ Công thức 4: Ngâm hạt trong dịch chiết sả 10% trong khoảng thời gian là
10 phút.
- Sau 7 ngày kiểm tra theo phương pháp giám định bệnh hại hạt giống trên lạc.
- Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mầm bình thường, tỷ lệ mầm dị dạng, tỷ lệ mầm bệnh.
2.5.5.4. Thử nghiệm dịch chiết từ củ tỏi trong việc ức chế nấm bệnh hại hạt giống lạc
- Củ tỏi rửa sạch, đem nghiền nhỏ, chắt lấy dịch, sau đó pha loãng ra thành
các nồng độ (2%, 5%, 10%) tùy theo mục đích sử dụng.
- Ngâm hạt giống lạc ở trong dịch chiết tỏi ở các nồng độ (2%, 5%, 10%) khác nhau trong thời gian 10 phút, sau đó chắt dịch chiết đi, thấm khô hạt qua giấy thấm nước đã được hấp vô trùng, đặt hạt trên giấy thấm.
- Tiến hành thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức là 50 hạt, nhắc lại 3 lần.
+ Công thức 1: đối chứng (không xử lý)
+ Công thức 2: Ngâm hạt trong dịch chiết tỏi 2% trong khoảng thời gian 10 phút. + Công thức 3: Ngâm hạt trong dịch chiết tỏi 5% trong khoảng thời gian 10 phút + Công thức 4: Ngâm hạt trong dịch chiết tỏi 10% trong khoảng thời gian 10 phút.
- Sau 7 ngày kiểm tra theo phương pháp giám định bệnh hại hạt giống trên lạc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả điều tra, nghiên cứu ngoài đồng ruộng