Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu
2.4.4.Phản ứng Real Time PCR (R T PCR) Nguyên lắ phản ứng
Nguyên lắ phản ứng
Phản ứng Real Time RT - PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các ựặc ựiểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch ựại ựược phát hiện qua phân tắch ựiểm kết thúc bằng cách ựiện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, Real Time RT - PCR cho phép phát hiện và ựịnh lượng sự tắch lũy DNA khuếch ựại ngay khi phản ứng ựang xảy ra. Khả năng này ựược phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết ựặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tắn hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp ựược tắn hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch ựại xảy ra. Ban ựầu, tắn hiệu huỳnh quang còn ở tắn hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tắn hiệu cho dù có quá trình khuếch ựại và sản phẩm ựã tăng theo hàm mũ. đến một thời ựiểm xác ựịnh, sản phẩm khuếch ựại ựã tạo ra ựủ tắn hiệu huỳnh quang có thể phát hiện ựược. Chu kỳ này ựược gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (cycle of threshold). đây cũng là giá trị ựể ựánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT - PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là Reverse Transcription nên phương pháp này ựược gọi là Real Time RT - PCR.
+ Nguyên lắ hoạt ựộng của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất ựược sử dụng trong phản ứng Real Time RT - PCR là Taqman probe.
Taqman probe ựược sử dụng như một trình tự oligonucleotide ựặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Bảng 2.1. Primer và probe dùng trong phản ứng RT - PCR
Modification PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5' - 3') 5' 3'
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None
M-4 (CDC)
Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA HEX BHQ1
Probe TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA TET BHQ1
Forward ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT TCA None None H5-3S
(AAHL+ Probe HA
2-3) Reverse AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC None None
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
N1-2 (China)
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở ựầu 5Ỗ- và một chất hấp phụ huỳnh quang ở ựầu 3Ỗ-. Khi còn nguyên vẹn, tắn hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ.
Trong giai ựoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch ựại, probe liên kết với trình tự ựắch và hoạt ựộng 5Ỗ - 3Ỗ exonuclease ựặc hiệu cho DNA mạch ựôi của Taq sẽ cắt ựứt ựầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tắn hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch ựại trong mẫu.
Các bước tiến hành phản ứng Real Time RT - PCR
Bao gồm các bước sau:
Chiết tách RNA
Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch ựệm RLT bổ sung β - Mecraptoethanol (β - ME) tỷ lệ 1/100 và dung dịch ựệm rửa RPE bổ sung 4 lần thể tắch ethanol. Mẫu sau khi ựược xử lắ sẽ tiến hành chiết tách RNA:
Bước 1: Cho 600ộl ựệm RLT (ựã ựược bổ sung β - Mecraptoethanol) vào ống eppendorf 1,5ml ựã ghi kắ hiệu ở trên nắp tube.
Bước 2: Chuyển 200ộl mẫu vào ống ependorf. Vortex trong 1 phút, sau ựó ly tâm (spin down) ựể kéo các phần bám trên nắp eppendorf xuống.
Bước 3. Cho thêm 400ộl cồn (ethanol) tuyệt ựối 100%. Vortex 15 giây, sau ựó ly tâm (spin down) ựể kéo các phần bám trên nắp eppendorf xuống.
Bước 4: Lắp khóa van vào hệ thống chân không và gắn cột lọc vào van ghi kắ hiệu mẫu trên nắp các spin colum vừa lắp. Bật máy hút chân không, ựiều chỉnh khóa van ựể P = 600. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 5: Chuyển hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc tương ứng, rút hết dung dịch trong cột lọc.
Bước 6: Thêm 700ộl dung dịch ựệm RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc.
Bước 7: Thêm 500ộl dung dịch ựệm rửa RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc.
Bước 8: Lặp lại bước 7.
Bước 9: Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, ly tâm 1.200 vòng/phút trong vòng 2 phút mục ựắch ựể loại bỏ hết dung dịch ựệm rửa RPE.
Bước 10: Lấy cột lọc ựặt vào ống eppendorf mới, cho vào cột lọc 50ộl nước Rnase - free H2O. Sau ựó giữ ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 11: Bỏ cột lọc, thu lấy RNA. Giữ RNA ở 40C ựể xét nghiệm trong vài giờ, lưu giữ ở -200C nếu chưa xét nghiệm ngay trong ngày.
Hình 2.1. Các bước chiết tách RNA bằng Qiagen Rneasy Mini Kit 600ộl ựệm RLT. 200ộl mẫu. Vortex trong 1 phút. 400 ộl cồn tuyệt ựối 100%. Vortex 15 giây, spin nhẹ. Gắn cột lọc và ựiều chỉnh hệ thống máy hút chân không.
Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc.
700ộl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc. 500ộl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc. Lặp lại lần 2. Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm 1200 vòng/phút trong 2 phút. Lấy cột lọc cho vào ống eppendorf. 50ộl nước Rnase - free. Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút. Thu lấy RNA.
Chuẩn bị Master mix
Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất ựệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương ựồng giữa primer và bộ gen ựã chiết tách. Quá trình Master mix ựược tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống eppendorf, vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như bảng 2.2:
Bảng 2.2. Các thành phần trong Master mix Reagent Lượng/1 mẫu (ộl)
Nước 10,5 5x Reaction mix 5,0 MgCl2 1,2 D NTP 0,8 P.P.P (mồi) 1,5 Enzyme mix 1,0 Tổng 20
Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf ta tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15giây.
Template mẫu
Template là quá trình chuẩn bị các ống mẫu trước khi chạy trên máy RT - PCR. Trước khi template mẫu, chuẩn bị ống PCR tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn ựoán. Sau ựó tiến hành theo các bước sau:
- Cho 20ộl hỗn hợp Master mix vào ống PCR.
- Cho 5ộl RNA mẫu ựã chiết tách ựược ở trên vào hỗn hợp Master mix của các ống mẫu.
dương (postive).
- Cho 5ộl nước Free RNase vào hỗn hợp Master mix của ống ựối chứng âm (negative).
Chạy máy Real Time RT - PCR
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT - PCR phát hiện cúm gia cầm type A/H5N1 bảng 2.3:
Bảng 2.3. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Real Time RT - PCR
RT (bước phiên mã ngược) PCR
500C - 30 phút
950C - 2 phút
40 chu kỳ x (950C - 10 giây + 580C - 50 giây)
đọc huỳnh quang ở bước Annealing - extension (=600C trong 30 giây). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đọc kết quả
Kết quả xét nghiệm ựược công nhận khi:
đối chứng dương (+) cho giá trị Ct ựã biết (ổ2) đối chứng âm (-) không có Ct
Mẫu dương tắnh khi giá trị Ct ≤ 35,0 Mẫu âm tắnh khi không có giá trị Ct Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35,0