(PED) TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.2.1. Tình hình nghiên cứu Porcine Epidemic Diarrhoea (PED) trên thế giới thế giới
Từ khi xuất hiện dịch cho tới nay, dịch tiêu chảy (PED) ựã lây lan và làm thiệt hại không ắt cho nền chăn nuôi lợn trên thế giới. Vì vậy mà các công trình nghiên cứu về PED ựã ựược tiến hành ở khắp các nước xảy ra dịch bệnh.
Năm 1982, (Pensaert và cs) ựã ựặt tên cho virus gây tiêu chảy cấp là
ỘPorcine Epidemic Diarrhoea Virus Ờ PEDVỢ. Trên cơ sở di truyền và kháng nguyên, PEDV ựược phân loại trong nhóm 1 của giống Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus gây bệnh cho chó, mèo.
Theo (Kocherhans và cs 2001) toàn bộ gen CV777 của PEDV ựã
ựược giải trình tự và xác ựịnh có chứa 28.033 nucleotide. Dựa trên trình tự amino acid của gen sao chép, PEDV ựược xem như là có mối quan hệ gần gũi nhất với coronavirus người 229E và TGEV.
Theo (Bridgen và cs 1993) trình tự xác ựịnh gen protein N quyết ựịnh rằng PEDV giữ một vị trắ trung gian giữa 229E và TGEV.
Các tác giả (Callebaut và DeBouck 1981); (Lee và Yeo 2003) ựã tìm ra các ựặc tắnh sinh hóa của virus: nhạy cảm với ether và chloroform, mật ựộ của nó trong sucrose là 1,18g/ml. Tế bào nuôi cấy thắch nghi với PEDV phải ổn ựịnh trong 500C, bị mất tác dụng lây nhiễm khi ở nhiệt ựộ 600C trong 30 phút. Virus sống ựược trong khoảng pH từ 4.0 ựến 9.0 ở 40C và khoảng pH từ 6.5 ựến 7.5 ở 370C. Virus không gây ngưng kết hồng cầu theo kết quả nghiên cứu của (Callebaut và DeBouck 1981).
Theo (Kweon và cs 1993) chỉ ra rằng không có thêm bằng chứng nào chứng tỏ có hơn một serotype của PEDV. Các ựoạn polypeptide phân lập ựược ở Korean cho thấy khối lượng phân tử cũng tương tự với dòng nguyên mẫu CV777.
Việc nghiên cứu virus PED trong phòng thắ nghiệm rất khó khăn. đã có rất nhiều loại tế bào ựược thử nghiệm ựể nuôi cấy PEDV nhưng vẫn
không thành công. Các tác giả (Hofmann và Wyler 1988, 1989); (Lee và Yeo 2003) ựã tìm ra tế bào Vero (thận khỉ xanh Châu Phi) ựể hỗ trợ công tác nối truyền các ựời của PEDV. Virus phát triển phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong môi trường nuôi cấy tế bào. Bệnh lý tế bào do virus gây ra là các thể không bào và hợp bào lên tới 100 nhân. Sau 15 giờ gây nhiễm virus nhân lên nhanh với hiệu giá cao nhất là 105,5 ựơn vị tế bào.
Ở Nhật, tác giả (Shibata và cs 2000) ựã nghiên cứu thành công sự nhân lên của virus PED trong tế bào bàng quang và thận lợn. Tiếp theo ựó, (Kadoi và cs 2002) ựã phân lập ựược dòng P Ờ 5V sử dụng như một chủng vacxin nuôi cấy trong tế bào dòng lợn KSEK6 và IB Ờ RS2.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu Porcine Epidemic Diarrhoea (PED) ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam có rất ắt các nghiên cứu về PEDV. Ở phắa nam Việt Nam có nghiên cứu của các tác giả (đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn và cs 2011), PED xảy ra lần ựầu tiên ở Việt Nam ựầu năm 2008. PEDV ở Việt Nam có sự khác biệt cao về một phần trình tự nucleotide của gen S so với các tài liệu ựã ựược công bố như PEDV phân lập ở châu Âu (Br1/87, CV777) và ở Hàn Quốc (Spk1, Chinju99, DR13 và KNU Ờ 0801). Mối quan hệ của 2 gen protein S và M ựã chỉ ra rằng PEDV ở Việt Nam giống với dòng virus phân lập ở Trung Quốc (JX Ờ 2004 Ờ 2 và DX), ở Thái Lan (07NP01, 08NP02 và 08CB01) và gần ựây là ở Hàn Quốc (KNU Ờ 0802 và CPF299). Từ các kết quả nghiên cứu trên chỉ ra rằng PEDV ở Việt Nam có nguồn gốc ở Trung Quốc, trải qua di truyền và biến thể nhiều ựời hình thành nên một PEDV mới ở Việt Nam.
Các tác giả (Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn đình Quát và cs 2012) ựã phân biệt virut PEDV và TGEV bằng phương pháp nested RT Ờ PCR trong các ổ dịch năm 2008 Ờ 2010. Trong 284 mẫu phân tắch có 41,09% mẫu dương tắnh với PEDV mà không phát hiện dương tắnh với TGEV và tỷ lệ
mẫu dương tắnh với PEDV ở ruột là 58,14% cao hơn mẫu phân 16,96%. Ngoài nghiên cứu của nhóm tác giả trên thì ở Việt Nam chưa có thêm một nghiên cứu nào ựược công bố ựể cho thấy sự lưu hành của bệnh PED ở các tỉnh thành khác. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu ựề tài này nhằm mục ựóng góp thêm một số hiểu biết và tình hình mắc bệnh PED ở miền Bắc Việt Nam.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. đỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Dịch tiêu chảy (PED) ở ựàn lợn nuôi tại một số trại lợn miền Bắc Ờ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG
1. Theo dõi một số ựặc ựiểm dịch tễ học của dịch tiêu chảy ở lợn: - Tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong theo ựịa phương, quy mô ựàn, lứa tuổi,
theo các tháng trong năm. - Triệu chứng, bệnh tắch của PED
2. Chẩn ựoán khẳng ựịnh bệnh bằng kỹ thuật chẩn ựoán nhanh và phương pháp RT Ờ PCR.
3. Can thiệp và ựánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống dịch tiêu chảy ở lợn tại một số tỉnh phắa Bắc Việt Nam.
2.3. THỜI GIAN VÀ đỊA đIỂM NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thời gian nghiên cứu: 10/2011 Ờ 6 /2013.
2.3.2. địa ựiểm nghiên cứu:
- Mẫu bệnh phẩm lấy từ một số trại lợn miền Bắc Việt Nam.
- Các xét nghiệm thực hiện tại Bộ môn: Vi sinh Ờ Truyền nhiễm, khoa Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.
2.4. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Nguyên liệu
Mẫu phân và phủ tạng của lợn con tiêu bị tiêu chảy. Kit chẩn ựoán nhanh PED, ống ựựng mẫu, ống hút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các hóa chất, hóa dược, trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thắ nghiệmẦ
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu ựược thu thập trên thực ựịa từ những lợn có biểu hiện lâm sàng tiêu chảy cấp tại các trại chăn nuôi ở một số ựịa phương thuộc miền Bắc Việt Nam.
Mẫu phủ tạng gồm: gan, hạch amidan, hạch lympho, thận, lách, phổi, ruột của lợn bị tiêu chảy cấp sau khi ựã chẩn ựoán bằng test chẩn ựoán nhanh. Bệnh tắch khi mổ khám thường quan sát ựược là toàn bộ ruột căng phồng, chứa nhiều nước, thành ruột mỏng chứa nhiều casein chưa tiêu hóa. Mẫu sau khi lấy ựược mang về phòng thắ nghiệm, bảo quản ở - 200C cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu phân ựược lấy từ ựoạn ruột sau khi mổ khám cho vào ống ựựng mẫu và bảo quản mẫu ở - 200C cho ựến khi kiểm tra.
Mẫu ựược thu thập trong thời gian từ năm 2012 Ờ 2013.
2.4.2.2. Phương pháp ựiều tra một số ựặc ựiểm dịch tễ
Chúng tôi thu thập thông tin từ các trại có dịch tiêu chảy từ các kỹ thuật viên của trại. Sau ựó, tiến hành các bước theo phương pháp dịch tễ học mô tả của (Nguyễn Như Thanh và cs 2001).
Phương pháp dịch tễ học mô tả là những nghiên cứu mô tả áp dụng cho một quần thể ựộng vật, mục tiêu của khảo sát là cung cấp những số liệu về sự lưu hành, tắnh phổ biến của các ựặc ựiểm như: tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết, tuổi mắc, giống loài mắc, thời ựiểm, mùa vụ mắc, tác nhân gây bệnh,
phương thức, tập quán chăn nuôi, quy trình phòng bệnh, tắnh chất lây lan, mức ựộ trầm trọng của bệnh v.v...
Khảo sát có thể bằng phương pháp trực tiếp và gián tiếp, trong khảo sát bằng phương pháp gián tiếp, thì sự quan sát do người khác làm và cung cấp theo mẫu khảo sát hay theo các câu hỏi mà người ựiều tra ựưa ra, còn khảo sát trực tiếp có thể bằng hình thức phỏng vấn cá nhân hoặc bằng thư tắn hoặc bằng ựiện thoại.
Giai ựoạn mô tả dịch tễ học gồm 5 bước: Bước 1: xác ựịnh có dịch
Sự xác ựịnh có dịch dựa trên nhận xét thấy số trường hợp mắc bệnh hoặc chết xảy ra cao hơn số trường hợp mắc bệnh hoặc chết xảy ra so với cùng thời kỳ năm trước (quý trước, tháng trước) ở trong cùng một quần thể.
Bước 2: xác ựịnh chẩn ựoán
+ Chẩn ựoán lâm sàng: dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tắch ựể bước ựầu xác ựịnh bệnh. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tắch ựiển hình thường dễ dàng phát hiện trong những trường hợp ựộng vật mắc bệnh ựầu tiên trong ổ dịch, sau ựó do nhiều nguyên nhân mà các dấu hiệu ựiển hình này bị che lấp hoặc lu mờ ựi, nên khó phát hiện, do ựó khi ựiều tra cần quan sát trên nhiều ựộng vật bệnh và mổ khám nhiều ựộng vật chết mới có thể thấy ựược ựầy ựủ các biểu hiện này.
+ Chẩn ựoán phi lâm sàng: trường hợp bệnh không thể hiện các triệu chứng và bệnh tắch ựiển hình, chưa xác ựịnh chắc chắn thì có thể sự dụng các phương pháp chẩn ựoán khác ựể chẩn ựoán như sử dụng kit chẩn ựoán nhanhẦ
định nghĩa ca bệnh là phải dựa trên những tiêu chuẩn lâm sàng hoặc tiêu chuẩn sinh vật học và ựược giới hạn về thời gian, ựịa ựiểm, loài vật cảm thụ; phải là những dấu hiệu ựiển hình, cụ thể, sát với tình hình dịch ựang xảy ra, nhưng lại phải ựơn giản dễ nhận biết.
Tắnh số ca bệnh trong quần thể ựiều tra, kèm theo thu thập thông tin giúp cho việc mô tả lịch sử tự nhiên của dịch như: tuổi, giống, loài, tắnh biệt, các dấu hiệu lâm sàng, thời gian khởi phát, thời gian nung bệnh, thời gian kéo dài, mức ựộ trầm trọng của bệnh và phương pháp ựiều trị.
Bước 4: Thu thập thông tin
Thông tin về ựịa ựiểm: tên, số ựiện thoại, ựịa chỉ chủ nhà ựể liên hệ khi cần thiết.
Thông tin nhận dạng: giống, lứa tuổi, tắnh biệt, ựể mô tả quần thể có nguy cơ.
Thông tin về lâm sàng: ựể xác ựịnh xem ựịnh nghĩa về ca bệnh có phù hợp không.
Thông tin về ngày xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng cho phép vẽ biểu ựồ thời gian của dịch.
Thông tin về các yếu tố nguy cơ khác: ựiểu tra dịch lây qua ựường tiêu hóa, sinh dục hay nhân tố trung gian truyền bệnhẦ
Thông tin về người báo cáo có dịch: cho phép khai thác thêm thông tin khác cần thiết từ họ hoặc ựể gửi báo cáo kết quả ựiều tra.
Bước 5: Tổng hợp số liệu ựiều tra
Tập hợp các số liệu theo thời gian, ựịa ựiểm và ựặc thù của loài ựộng vật mắc bệnh, dựa trên các số liệu thu thập ựượcẦ xây dựng bảng biểu. (Nguyễn Như Thanh và cs 2011)
2.4.2.3. Phương pháp chẩn ựoán PED bằng test chẩn ựoán nhanh
Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất Bionote, Hàn Quốc: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi trại lợn có lợn con theo mẹ bị mắc tiêu chảy, nghi ngờ PED ta mổ khám và sau ựó lấy một ắt dịch ruột của lợn con bị tiêu chảy cho vào ống ựựng mẫu. Lắc ựều huyễn dịch. Sau ựó, dùng ống hút hút một lượng nhỏ huyễn dịch trong ống ựựng mẫu ựó nhỏ vào vị trắ ựựng mẫu của test chẩn ựoán nhanh (Anigen Rapid PED Ag Test kit).
đọc kết quả:
Ớ Kết quả âm tắnh là test chẩn ựoán chỉ có 1 vạch màu hồng. Ớ Kết quả dương tắnh là test chẩn ựoán có 2 vạch màu hồng.
2.4.2.4. Phương pháp chẩn ựoán PED bằng phương pháp RT Ờ PCR Tách chiết RNA của virus bằng Trizol (Invitrogen)
Các bước ựược tiến hành theo sự chỉ dẫn của Kit. Cụ thể như sau:
Bước 1: Bổ sung 800ộl dung dịch Trizol vào 200ộl huyễn dịch virus, vortex và sau ựó bổ sung tiếp 200ộl dung dịch Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút.
Bước 2: Giải phóng RNA:
Huyễn dịch trên ựược ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, chuyển pha trên có chứa RNA vào một ống Eppendorf mới (với lượng khoảng 500ộl).
Bước 3: Kết tủa RNA:
Bổ sung 500ộl dung dịch Isopropanol, ly tâm 12000 vòng/ phút/ 10 phút ở 40C.
Bỏ dịch trên, thu cặn RNA. Thêm 1ml ethanol 75% vào cặn RNA thu ựược. Lắc bằng máy vortex trong 15 giây. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C.
Bước 5: Tan tủa RNA và thu RNA:
Loại bỏ phần dịch phắa trên, hòa RNA trong 30ộl nước cất 3 lần ựã loại Rnase và bảo quản ở - 700C.
Phương pháp tổng hợp cDNA
cDNA ựược tổng hợp từ RNA ựã ựược tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT.
Mẫu ARN sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng 2.1:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy
(ộl)
Nước ựã loại RNase 4.5
Mẫu RNA tinh sạch 5
dNTPs (2.5mM mỗi loại) 3
Mồi oligo dT (200pM/ộl) 2
Superscript TM II Rnase H-reverse transcriptase
(200U/ộl) 1
RNase inhibitor (10U/ộl) 0.5
5x first strand buffer 4
Phản ứng tổng hợp cDNA ựược thực hiện ở 370C trong 60 phút và sau ựó 940C trong vòng 5 phút.
Phương pháp PCR phát hiện PEDV
Sự có mặt của PEDV trong mẫu bệnh phẩm ựược xác ựịnh thông qua primer ựặc hiệu với gen mã hóa Spike protein (S gen), theo (Kim và cs 2001). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2. Trình tự mồi S
Tên mồi Trình tự mồi( 5Ỗ-3Ỗ) Kắch
thước
Mồi xuôi TTCTGAGTCACGAACAGCCA
Mồi ngược CATATGCAGCCTGCTCTGAA
651 bp Thành phần phản ứng PCR thể hiện ở bảng 2.3:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT Ờ PCR
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy
cDNA 1(ộl)
Mồi xuôi/ngược 25pmol
dNTPs (mỗi loại) 0,2mM
Tris Ờ HCl (pH =8,8) 10mM
MgCl2 1,25mM
KCl 50mM
Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C/30 giây, 530C/30 giây, 720C/60 giây; lặp lại 35 vòng.
Chạy ựiện di trên gel agarose ựọc kết quả: chuẩn bị thạch ựể ựiện
di, sau ựó ựọc kết quả như sau:
- Mẫu dương tắnh với virus khi giếng chứa mẫu ựiện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với ựộ dài ựoạn gen nhân lên (bp).
- Mẫu âm tắnh khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với ựộ dài ựoạn gen khuếch ựại mong ựợi.
2.4.2.5. Phương pháp can thiệp
Trên cơ sở tham khảo tài liệu và thực tế sản xuất tại trại, chúng tôi tiến hành xây dựng các biện pháp can thiệp vào ổ dịch: theo dõi tỷ lệ ốm, tỷ lệ tử vong của lợn ựược can thiệp.
2.4.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu ựược xử lý bằng phần mềm MS Excel 2003, sau ựó so sánh sự sai khác giữa các yếu tố nghiên cứu bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 8.1).
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THEO DạI MỘT SỐ đẶC đIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA DỊCH TIÊU CHẢY Ở LỢN CỦA DỊCH TIÊU CHẢY Ở LỢN
3.1.1. Tình hình mắc PED theo ựịa phương
3.1.1.1. Tình hình mắc PED ở các trại
Vào những năm gần ựây, tình hình dịch bệnh ở lợn xảy ra nghiêm trọng và khó kiểm soát. Ngoài những bệnh thường mắc như dịch tả lợn, giả dại, TGE, v.vẦlợn con theo mẹ còn mắc một bệnh mới ựang lưu hành ở Việt Nam ựó là PED. Bệnh xảy ra chủ yếu là lợn con theo mẹ, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong cao. Chúng tôi ựã tiến hành theo dõi tình hình PED ở ựàn lợn nuôi tại 9 tỉnh thành miền Bắc.
Tình hình PED ở một số trại lợn tại miền Bắc Việt Nam, ựược trình bày ở bảng 3.1: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Kết quả mắc PED ở các trại TT địa ựiểm lấy
mẫu
Số trại theo dõi Số trại dương tắnh Tỷ lệ mắc (%) 1 Hải Phòng 5 2 40,0 2 Hải Dương 3 2 66,7 3 Hưng Yên 3 3 100 4 Hà Nam 4 2 50,0 5 Hà Nội 8 6 75,0 6 Vĩnh Phúc 3 1 33,3 7 Hòa Bình 5 2 40,0 8 Bắc Giang 4 0 0,0 9 Sơn La 3 1 33,3 Tổng 38 19 50,0
Qua bảng 3.1 và hình 3.1, tình hình mắc bệnh trong 38 trại theo dõi ựã có tới 19 trại mắc PED tỷ lệ mắc lên tới 50,0%. PED ựang dần lây lan rộng ra các ựịa phương ở miền Bắc hơn khi tình hình kiểm soát dịch không tốt và chưa có hiểu biết nhất ựịnh về bệnh. Giữa các tỉnh có sự sai khác về tỷ lệ mắc bệnh trong các trại theo dõi. (P<0,05).
Hình 3.1 Tình hình mắc bệnh PED ở các trại theo ựịa phương
Trong ựó, số trại ở Hà Nội có 6 trại bị mắc bệnh PED trong số 8 trại ựiều tra, tỷ lệ mắc cao (75,0%). Tiếp ựó, ở Hưng Yên có 3 trại mắc trên 3 trại theo dõi, ở Hà Nam có 2 trại mắc trên 4 trại theo dõi, ở Hải Dương có