2.5.4.1. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng * Bộ kắt INDEXX Herd Check gồm:
- đĩa nhựa 96 giếng - đối chứng dương, âm
- Nước rửa (washing concentrate) 10X. Khi sử dụng, pha nước rửa thành nồng ựộ 1X (1/10 nước rửa 10X và 9/10 nước cất).
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent)..
- Anti-Porcine HRPO conjugate- kháng kháng thể có gắn enzyme.
- TMB (3, 3, 5, 5 tetra methyl benzidine) substrate - hỗn hợp chất phát màu và cơ chất của phản ứng ELISA.
- Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution). * Mẫu huyết thanh cần chẩn ựoán.
* Dụng cụ phòng thắ nghiệm bao gồm: máng ựể ựổ nguyên liệu, pipet ựơn, ựa kênh, máy ựọc ELISA...
* Sơ ựồ ựĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C A đC + đC+ 7 7 B đC - đC - C 1 1 D 2 2 E 3 3 F 4 4 G 5 5 H 6 6 46 46
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
30
2.5.4.2. Chuẩn bị
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh bằng cách pha loãng huyết thanh cần kiểm tra ở nồng ựộ 1/40 (10 ộl huyết thanh + 390 ộl PBS).
+ Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng: Trước khi làm phản ứng, lấy nguyên liệu ra ựể ở nhiệt ựộ phòng từ 5- 10 phút.
+ Chuẩn bị ựĩa phản ứng.
2.5.4.3. Các bước tiến hành
- Bước 1: Nhỏ ựối chứng dương và âm theo ựúng sơ ựồ ựĩa ELISA (trang 38), với lượng 100 ộl.
- Bước 2: Nhỏ mẫu huyết thanh ựã chuẩn bị vào vị trắ từ 1 ựến 46 theo theo ựúng sơ ựồ. Mỗi giếng nhỏ lượng 100 ộl.
- Bước 3: ủ 30 phút ở nhiệt ựộ phòng.
- Bước 4: Rửa ựĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch rửa.
- Bước 5: Nhỏ 100 ộl conjugate vào tất cả các giếng - Bước 6: ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút.
- Bước 7: Rửa ựĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch rửa.
- Bước 8: Nhỏ 100 ộl TMB
- Bước 9: ủ ở nhiệt ựộ phòng 15 phút.
- Bước 10: Nhỏ 100 ộl dung dịch dừng phản ứng.
- Bước 11: đọc kết quả ở bước sóng 650 nm, nhờ máy ựọc ELISA Labsystems multiskan MS.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
31 (∑OD sample - ∑ODneg)
S/P =
Giá trị trung bình (∑OD pos - ∑ODneg)
Chú thắch:
OD sample: Giá trị mật ựộ quang của mẫu chẩn ựoán.
OD pos : Giá trị mật ựộ quang ựối chứng dương. ODneg: Giá trị mật ựộ quang ựối chứng âm.
2.5.4.4. Cách ựánh giá kết quả
- Khi giá trị S/P ≥ 0,4: dương tắnh; - Khi giá trị S/P < 0,4: âm tắnh