đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI, cell mediated immunity) có vai trò rất quan trọng ựối với PRRSV. Sự hiểu biết về ựáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của cơ thể chống PRRSV còn hạn chế. Những nghiên cứu ựầu tiên cho thấy sự tăng tế bào lympho xuất hiện ngắn từ 3- 9 ngày là dấu hiệu của lợn nhiễm PRRSV. Tuy nhiên, ở ngày thứ 14 sau khi nhiễm, tổng số tế bào ở mạch ngoại vi ở mức bình thường. Sự tăng tế bào lympho TCD8 làm người ta giả thiết rằng những tế bào T tiết ựộc tố tế bào ựặc hiệu ựược tạo ra (Trần Thị Bắch Liên, 2008). PRRSV ngăn cản sự trình diện kháng nguyên và hoạt hoá tế bào lympho T, ựồng thời làm giảm ựáp ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách thay ựổi hình dạng của tế bào thực bào và làm giảm sự xuất hiện phân tử trình diện kháng nguyên ựi kèm trên bề mặt tế bào ựại thực bào trong việc trình diện kháng nguyên.
Những cá thể lợn ựang bình phục có sự ựáp ứng tăng sinh mạnh các tế bào lympho, hiện tượng này không ựược phát hiện trong 4 tuần sau nhiễm trùng và cùng với ựáp ứng với kháng thể trung hoà. Các ựáp ứng có vai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN-c) và IL-2 nhưng vai trò interferon kéo dài ắt hơn so với interleukin.
+ Interferon (IFN): Do tế bào nhiễm virut tiết ra, ựể ngăn cản virut ựó vào lần sau, cũng như tạo bức tường ngăn cản virut xâm nhập sang tế bào khác. PRRSV rất nhạy cảm với tác ựộng của IFN type I, chúng có thể ựã ựề kháng lại với những phản ứng của IFN- Alfa, thậm chắ cả IL- 10 và IL- 12 trong tế bào thực bào và tế bào tua. Vì thế PRRSV có thể phá huỷ hàng loạt tế bào ựại thực bào.
+ Vai trò của Interleukin (IL): IL- 10 có vai trò quan trọng trong ựiều hoà ựáp ứng miễn dịch ựối với PRRSV. Sau khi nhiễm PRRSV, hiệu giá của ARNtt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
23 của IL- 10 ựã tăng lên ở các tế bào phế nang phổi của lợn và trong dịch rửa phế quản.
+ Vai trò Ộtự nguyện chếtỢ (Apoptosis): ở những lợn nhiễm PRRSV người ta tìm thấy nhiều tế bào chết do cơ chế này ở các mô bị nhiễm ựặc biệt ở phổi, tinh hoàn và hạch amidal. Tuy nhiên, PRRSV gây ra hiện tượng apoptosis trực tiếp, gián tiếp hay qua tắn hiệu truyền tải thì hiện nay còn chưa rõ ràng.
1.8. Phòng và ựiều trị PRRS
1.8.1. Vệ sinh phòng bệnh
để phòng PRRS cần phải thực hiện ựồng bộ nhiều biện pháp, nhất là trong ựiều kiện thực tế của Việt Nam. để các biện pháp vệ sinh phòng bệnh ựạt hiệu quả, việc thay ựổi phương thức chăn nuôi từ nhỏ lẻ, phân tán sang chăn nuôi lớn tập trung, nhập con giống phải khoẻ mạnh rõ nguồn gốc ựóng vai trò quan trọng ựầu tiên. Bên cạnh ựó, cần phải áp dụng triệt ựể các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi, chuồng trại phải ựảm bảo vệ sinh an toàn thú y. Thường xuyên chăm sóc tốt cho lợn ựể nâng cao sức ựề kháng cho lợn, ựối với lợn mới mua về không rõ nguồn gốc cần cách ly ắt nhất 3 tuần ựể theo dõi.
1.8.2. Phòng bệnh bằng vacxin
Hiện nay chưa có loại thuốc nào ựặc hiệu ựiều trị PRRS. Có thể sử dụng một số thuốc tăng cường sức ựề kháng, ựiều trị triệu chứng và chủ yếu là ngăn ngừa bệnh kế phát. Chắnh vì vậy, ựể phòng chống bệnh ngoài việc chăn nuôi an toàn sinh học, chăm sóc nuôi dưỡng tốt ... thì việc tiêm vacxin phòng bệnh cũng là một giải pháp hữu hiệu.
Việc tiêm vacxin sẽ giúp tạo ựược miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cho ựàn lợn, làm giảm tình trạng mẫn cảm của gia súc với chủng virut gây bệnh. Cũng cần nêu lên rằng vai trò của miễn dịch dịch thể (kháng thể) kháng PRRSV trong việc bảo hộ ký chủ hiện vẫn chưa ựược xác ựịnh rõ (Nguyễn Tiến Dũng, 2011).
1.9. Vacxin PRRS
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
24 phòng bệnh lợn PRRS là RespPRRS/Repro và Prime PacTai xanhra ựời sau ựó 2 năm (1996). Và ựến nay, trên thế giới ựã có rất nhiều loại vacxin phòngTai xanhựược sản xuất.
Trong danh mục thuốc thú y của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam có bảy loại vacxin phòng bệnh lợn PRRS ựược cấp phép nhập khẩu lưu hành là:
- Vacxin Porcilis của MSD Animal Health (Merck).
- Vacxin AmervacTai xanhcủa Hipra- Tây Ban Nha chủng vacxin VP046BIS
- Vacxin BSL- PS 100 của Besta- Singapore, chủng vacxin JKL 100 thuộc dòng Bắc Mỹ.
- Vacxin vô hoạt chủng NVDC - JXA1 của Công ty Chengdu - Trung Quốc, thuộc dòng Bắc Mỹ.
- Vacxin IngelvacTai xanhMLV của Boehringer.
- Vacxin nhược ựộc chủng JXA1 - R của Công ty CAHIC Trung Quốc. - Vacxin nhược ựộc thể ựộc lực cao chủng JXA1- R của Công ty đại Hoa Nông Trung Quốc, thuộc dòng Bắc Mỹ.
Sự thành công của một loại vacxin PRRS cần có những yếu tố cơ bản như sau:
+ Virut vacxin có thể tồn tại hàng tuần, hàng tháng. Sự tồn tại của nó trong cơ thể lợn có thể song song với sự có mặt của virut thực ựịa (Mengeling và cs, 1996a).
+ Virut vacxin có thể ựược truyền từ lợn tiêm vacxin sang lợn không ựược tiêm vacxin (Mengeling và cs, 1998).
+ Virut vacxin có thể truyền qua nhau thai, gây ra hiện tượng tự nhiễm bẩm sinh (Mengeling và cs, 1996b).
+ Virut có thể tồn tại rất lâu ở lợn ựực và nó có thể truyền qua tinh dịch (Christopher - Henning và cs, 1997).
+ Vacxin vô hoạt kắch thắch quá trình ựáp ứng miễn dịch chậm và hầu như không tạo ra miễn dịch tế bào (Mengeling và cs, 1996a).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
25 + Thời gian hình thành ựáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào mối quan hệ của dòng virut vacxin và dòng virut thực ựịa. Sự tương ựồng càng cao về cấu trúc gen thì quả trình ựáp ứng miễn dịch diễn ra càng mạnh, càng nhanh và thời gian miễn dịch kéo dài (Mengeling, 1998).
+ Vacxin có hiệu quả khi nó có thể truyền virut vacxin thẳng qua nhau thai và truyền ngang ựối với các cá thể khác trong bầy ựàn (Botner và cs, 1997).
- Vacxin PRRS do Công ty TNHH thuốc thú y đại Hoa Nông sản xuất từ PRRSV chủng JXA 1- R từ lợn mắc bệnh sốt cao nuôi cấy trên tế bào Marc- 145, sau thời gian nuôi cấy thắch hợp, thu hoạch tế bào bị nhiễm, thêm chất bảo quản rồi ựông khô. Vacxin này dùng ựể phòng bệnh lợn PRRS thể ựộc lực cao. Kết quả chuẩn ựộ virut trên tế bào cho hàm lượng siêu vi trùng ựạt trên 105.0TCID50 /liều vacxin. Vacxin dùng ựể tiêm phòng cho; lợn con sau khi sinh từ 2 tuần tuổi; lợn nái sinh sản từ 14 - 20 ngày sau khi sinh; lợn nái hậu bị tiêm vacxin trước khi phối giống 4 tuần, lợn ựực giống ngừng khai thác tinh trong vòng 2 tuần sau khi tiêm vacxin. Liều tiêm 2ml/con (1 liều), kháng thể xuất hiện từ ngày thứ 7, miễn dịch cao nhất từ 21 - 28 ngày sau khi tiêm, ựộ dài miễn dịch là 06 tháng. đường tiêm; tiêm bắp, sau hốc tai. Hạn sử dụng; 18 tháng. Vacxin bảo quản ở nhiệt ựộ - 150c, bảo quản và vận chuyển ở nhiệt ựộ mát 2 - 80c ựược 6 tháng. Vacxin ựược tiêm nhắc lại sau 4 tháng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
26
Chương 2:
đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 đối tượng nghiên cứu
- Vacxin nhược ựộc ựông khô chủng JXA1-R do Công ty đại Hoa Nông Trung Quốc sản xuất.
- động vật thắ nghiệm: Lợn các lứa tuổi.
2.2 địa ựiểm nghiên cứu
- Các trang trại hoặc các hộ chăn nuôi lợn thuộc tỉnh Quảng Nam. - Chi cục Thú y tỉnh Quảng Nam.
- Tại Trung tâm Chẩn ựoán Thú y trung ương. - Cơ quan Thú y Vùng 4.
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1. điều tra tình hình chăn nuôi lợn tại tỉnh Quảng Nam tắnh ựến thời ựiểm nghiên cứu. nghiên cứu.
2.3.2. Tình hình dịch PRRS tại tỉnh Quảng Nam.
2.3.3. đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin nhược ựộc chủng JXA1-R trong phòng chống dịch PRRS tại tỉnh Quảng Nam năm 2013. chống dịch PRRS tại tỉnh Quảng Nam năm 2013.
2.3.4. Ước tắnh hiệu quả kinh tế khi sử dụng vacxin JXA1- R phòng chống dịch PRRS tại tỉnh Quảng Nam năm 2013.
2.3.5. đề xuất một số giải pháp trong sử dụng vacxin JXA1- R trong phòng chống dịch PRRS tại tỉnh Quảng Nam.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
27
2.4. Nguyên liệu
- Vacxin nhược ựộc ựông khô chủng JXA 1- R do Công ty đại Hoa Nông, Trung Quốc sản xuất ựược nhập khẩu bởi Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương I - VINAVETCO cung cấp.
Thành phần Khối lượng/liều ml - Virut PRRS chủng JXA1-R ≥105.0 TCID50/ liều - Tá dược: Skimmed milk
- Sucrose
120mg/ml 50 mg/ml Chỉ ựịnh và liều dùng: Dùng ựể phòng PRRS.
* Lợn hậu bị, lợn nái: tiêm phòng trước khi phối giống 30 ngày. * Lợn nái, lợn con sau khi sinh từ 14 - 28 ngày.
* Lợn ựực giống: Ngừng khai thác tinh 2 tuần sau khi tiêm vacxin. Liều tiêm: 2ml/con tiêm sâu sau hốc tai.
* Sau 4 tháng lợn ựược tiêm nhắc lại.
- Lợn thắ nghiệm: Là lợn các lứa tuổi ựược nuôi trang trại và hộ chăn nuôi tại tỉnh Quảng Nam.
- Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất của phòng thắ nghiệm thuộc Trung tâm Chẩn ựoán Thú y trung ương, Cơ quan Thú y vùng 4, Chi cục thú y Quảng nam. - Các nguyên vật liệu khác: chuồng trại, thức ăn, nước uống, chăm sóc và nuôi dưỡng theo ựiều kiện thực tế của trại lợn, hộ chăn nuôi.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp ựiều tra tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch PRRS tạitỉnh Quảng Nam: tỉnh Quảng Nam:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
28 - Phương pháp ựiều tra dịch tễ học mô tả sử dụng phiếu ựiều tra.
- Phương pháp ựiều tra dịch tễ học hồi cứu. 2.5.2. Phương pháp ựánh giá tắnh an toàn của vacxin
Theo dõi các biểu hiện khác thường của lợn trong vòng 3 - 7 - 14 ngày sau khi tiêm vacxin, ựánh giá kết quả.
2.5.2.1. Các chỉ tiêu theo dõi.
- Biểu hiện triệu chứng, lâm sàng trên lợn ựược tiêm phòng. - Số lợn chết.
- Phản ứng cục bộ tại nơi tiêm. - Tăng trọng bình quân hàng ngày. 2.5.2.2. Cách ựánh giá kết quả:
Vacxin ựạt yêu cầu khi:
- Không có lợn chết trong thời gian theo dõi.
- Không có những biểu hiện lâm sàng bất thường nào xảy ra do vacxin trong thời gian khảo nghiệm.
- Không có phản ứng bất lợi nào xảy ra trong 2 giờ sau khi tiêm vacxin và trong suốt 14 ngày sau khi tiêm vacxin.
- Không có phản ứng cục bộ nào tại vị trắ tiêm trong thời gian theo dõi. - Tăng trọng của lợn không bị ảnh hưởng bởi vacxin trên những lợn ựã ựược tiêm vacxin.
2.5.3. Phương pháp quan sát triệu chứng lâm sàng, bệnh tắch ựại thể.
Triệu chứng lâm sàng ựược theo dõi bao gồm các chỉ số về thân nhiệt, tần số hô hấp, tần số tim mạch và các biểu hiện lâm sàng khác trên lợn. Bệnh tắch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
29 ựại thể ựược quan sát thông qua mổ khám theo quy trình mổ khám của Cục Thú y.
2.5.4. Phương pháp ELISA gián tiếp
2.5.4.1. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng * Bộ kắt INDEXX Herd Check gồm:
- đĩa nhựa 96 giếng - đối chứng dương, âm
- Nước rửa (washing concentrate) 10X. Khi sử dụng, pha nước rửa thành nồng ựộ 1X (1/10 nước rửa 10X và 9/10 nước cất).
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent)..
- Anti-Porcine HRPO conjugate- kháng kháng thể có gắn enzyme.
- TMB (3, 3, 5, 5 tetra methyl benzidine) substrate - hỗn hợp chất phát màu và cơ chất của phản ứng ELISA.
- Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution). * Mẫu huyết thanh cần chẩn ựoán.
* Dụng cụ phòng thắ nghiệm bao gồm: máng ựể ựổ nguyên liệu, pipet ựơn, ựa kênh, máy ựọc ELISA...
* Sơ ựồ ựĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C PRR S NH C A đC + đC+ 7 7 B đC - đC - C 1 1 D 2 2 E 3 3 F 4 4 G 5 5 H 6 6 46 46
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
30
2.5.4.2. Chuẩn bị
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh bằng cách pha loãng huyết thanh cần kiểm tra ở nồng ựộ 1/40 (10 ộl huyết thanh + 390 ộl PBS).
+ Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng: Trước khi làm phản ứng, lấy nguyên liệu ra ựể ở nhiệt ựộ phòng từ 5- 10 phút.
+ Chuẩn bị ựĩa phản ứng.
2.5.4.3. Các bước tiến hành
- Bước 1: Nhỏ ựối chứng dương và âm theo ựúng sơ ựồ ựĩa ELISA (trang 38), với lượng 100 ộl.
- Bước 2: Nhỏ mẫu huyết thanh ựã chuẩn bị vào vị trắ từ 1 ựến 46 theo theo ựúng sơ ựồ. Mỗi giếng nhỏ lượng 100 ộl.
- Bước 3: ủ 30 phút ở nhiệt ựộ phòng.
- Bước 4: Rửa ựĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch rửa.
- Bước 5: Nhỏ 100 ộl conjugate vào tất cả các giếng - Bước 6: ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút.
- Bước 7: Rửa ựĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch rửa.
- Bước 8: Nhỏ 100 ộl TMB
- Bước 9: ủ ở nhiệt ựộ phòng 15 phút.
- Bước 10: Nhỏ 100 ộl dung dịch dừng phản ứng.
- Bước 11: đọc kết quả ở bước sóng 650 nm, nhờ máy ựọc ELISA Labsystems multiskan MS.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
31 (∑OD sample - ∑ODneg)
S/P =
Giá trị trung bình (∑OD pos - ∑ODneg)
Chú thắch:
OD sample: Giá trị mật ựộ quang của mẫu chẩn ựoán.
OD pos : Giá trị mật ựộ quang ựối chứng dương. ODneg: Giá trị mật ựộ quang ựối chứng âm.
2.5.4.4. Cách ựánh giá kết quả
- Khi giá trị S/P ≥ 0,4: dương tắnh; - Khi giá trị S/P < 0,4: âm tắnh
2.5.5. Phương pháp ựánh giá hiệu quả sử dụng vacxin trong chống dịch
Sử dụng các thông số về chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật của ựàn lợn nuôi, ước tắnh hiệu quả kinh tế khi sử dụng vacxin nhược ựộc chủng JXA1- R trong phòng chống dịch PRRS. Ước tắnh thiệt hại kinh tế khi dịch xẩy ra không sử dụng vacxin phòng chống dịch. So sánh hai giá trị kinh tế ựể làm rõ hiệu quả sử dụng vacxin nhược ựộc chủng JXA1- R trong phòng chống dịch PRRS.
2.5.6. Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu thu thập ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Excel 2007 và Minitab 16.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ
32
Chương 3:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình chăn nuôi lợn tại tỉnh Quảng Nam năm 2013
Quảng Nam là tỉnh nằm ở miền Trung của Việt Nam, cách thủ ựô Hà Nội 860 km. Phắa Bắc giáp tỉnh Thừa Thiên Huế và thành phố đà Nẵng, phắa Nam giáp tỉnh Quảng Ngãi và tỉnh Kon Tum và cách Thành phố Hồ Chắ Minh 865 km, phắa Tây giáp tỉnh Sekong (Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào); phắa đông giáp biển đông. Tổng diện tắch ựất tự nhiên của tỉnh là 1.043.836,96