Thí nghiệm sử dụng nguồn giống chủng là các dòng nấm mốc đã được phân lập từ 11 loại men khác nhau nuôi cấy trên môi trường PGA có bổ sung khoáng cần thiết sau 3 ngày ủ ở 30oC cho sinh bào tử và được đường hóa trên khối gạo hấp. Hoạt tính nấm mốc được xác định thông qua sự phát triển của khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH, độ Brix và thể tích dịch rỉ sau 3 ngày ủ mốc ở 30oC. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3 và 4.
Bảng 3. Sự xuất hiện khuẩn ty của các dòng nấm mốc đã phân lập
STT Dòng
nấm mốc
Sự xuất hiện khuẩn ty (ngày)
1 2 3 1 M.1.1 - + ++ 2 M.1.2 + ++ +++ 3 M.2.1 + ++ +++ 4 M.2.2 + ++ ++ 5 M.3.1 - + ++ 6 M.3.2 ++ +++ ++++ 7 M.4.1 - ++ +++ 8 M.4.2 + ++ +++ 9 M.5.1 ++ +++ ++++ 10 M.5.2 + + ++ 11 M.6.1 - + ++ 12 M.6.2 + ++ +++ 13 M.7.1 - + ++ 14 M.7.2 ++ +++ ++++ 15 M.8.1 + ++ +++ 16 M.8.2 ++ +++ ++++ 17 M.9.1 - + ++ 18 M.9.2 ++ +++ ++++ 19 M.10.1 - + ++ 20 M.10.2 ++ ++ +++ 21 M.11.1 + + ++ 22 M.11.2 + + +++ ++++
Ghi chú: Khuẩn ty xuất hiện theo mức độ tăng dần từ ít (+) đến nhiều (++++)
Bảng 4. Khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc STT Dòng nấm mốc Thể tích dịch rỉ (ml) Độ Brix sau ủ mốc pH Trước ủ Sau ủ 1 M.1.1 21,07ij 28,63ab 6,12 4,87b 2 M.1.2 25,33c 28,10ab 6,11 4,53ef 3 M.2.1 23,13efg 28,00ab 5,83 3,96h 4 M.2.2 24,03de 28,00ab 6,08 4,46f 5 M.3.1 22,27gh 28,57ab 6,25 5,19a 6 M.3.2 18,30k 22,10hi 5,84 3,44k 7 M.4.1 23,70def 28,60ab 5,98 4,91b 8 M.4.2 20,07j 23,93f 5,69 3,73ij 9 M.5.1 22,33gh 21,60i 5,72 3,40k 10 M.5.2 28,33b 25,33e 6,01 4,28g 11 M.6.1 21,60hi 28,43ab 6,28 4,81bc 12 M.6.2 30,90a 22,93gh 5,88 3,82hi 13 M.7.1 23,67def 27,70bc 6,31 4,70cd 14 M.7.2 18,47k 24,47ef 5,48 3,75ij 15 M.8.1 30,30a 28,73a 6,26 4,61def 16 M.8.2 22,47gh 24,70ef 6,03 3,68ij 17 M.9.1 24,33cd 28,20ab 6,26 4,49ef 18 M.9.2 17,60k 23,83fg 6,11 3,63j 19 M.10.1 22,67fgh 27,73bc 6,27 4,62de 20 M.10.2 17,37k 21,67i 5,91 3,67ij 21 M.11.1 28,03b 26,33d 6,02 4,52ef 22 M.11.2 21,67hi 26,80cd 6,05 3,80i CV (%) 3,14 2,19 2,29
Ghi chú: Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy là 95%.
Sự xuất hiện của khuẩn ty và dịch rỉ tăng dần theo thời gian trong quá trình ủ mốc. Các dòng nấm mốc M.3.2, M.4.2, M.5.1, M.7.2, M.8.2, M.9.2, M.10.2, M.11.2 khuẩn ty phát triển khá mạnh sau 1 ngày ủ mốc, khuẩn ty lan rộng dày đặc khắp khối gạo hấp trong bình tam giác và sau 2 ngày ủ bắt đầu xuất hiện dịch rỉ nhưng rất ít, ở các dòng nấm mốc này hạt cơm hầu như còn nguyên, nước giữ lại tạo thành khối cháo đặc. Ở các dòng mốc M.5.2, M.6.2, M.8.1, M.11.1 không thấy sự phát triển nhiều của hệ khuẩn ty, nhưng sau 1 ngày ủ đã thấy xuất hiện dịch rỉ và lượng dịch rỉ này gia tăng
theo thời gian ủ, dịch thủy phân dạng trong, sau khi tách dung dịch thủy phân ra, phần xác xốp rời không dính với nhau. Các dòng nấm mốc còn lại dịch thủy phân hơi đục, sau khi tách dịch thủy phân, phần xác nhão dính bết vào nhau.
Qua đó ta có thể nhận thấy trong 22 dòng nấm mốc trên có 2 đặc tính khác nhau: một là theo hướng sinh ra enzyme (M.1.1, M.1.2, M.2.1, M.2.2, M.3.1, M.4.1, M.5.2, M.6.1, M.6.2, M.7.1, M.8.1, M.9.1, M.10.1, M.11.1), còn một dạng là theo hướng phát triển sinh khối (các dòng M.3.2, M.4.2, M.5.1, M.7.2, M.8.2, M.9.2, M.10.2, M.11.2).
Sau 3 ngày ủ giá trị pH đã giảm xuống khoảng từ 6 xuống còn 3,4 - 5,0. pH là một trong những chỉ tiêu đánh giá sự thành công của quá trình lên men khối mốc ủ vì nếu bị tạp nhiễm bởi các vi khuẩn có hại (thường là vi khuẩn gây chua) thì giá trị pH thường giảm thấp một cách đáng kể chỉ còn khoảng 3,0 (Lê Hoàng Thanh Tuấn, 2012)
Kết quả xử lý thống kê cho thấy trong số 22 dòng mốc thì có dòng mốc M.8.1 từ An Giang là có khả năng đường hóa mạnh nhất. Quan sát khả năng đường hóa theo 3 ngày ủ thì nhận thấy khuẩn ty của dòng M.8.1 tuy phát triển ít hơn so với các dòng khác nhưng lại cho hoạt tính đường hóa rất cao.
Dịch rỉ xuất hiện nhiều vào ngày thứ 2 và càng tăng lên ở ngày thứ 3. Dịch rỉ của dòng M.8.1 sánh đặc và trong.
Sau 3 ngày ủ mốc lượng dịch rỉ của dòng M.6.2 (30,9ml) và dòng M.8.1 (30,3ml) sinh ra nhiều và khác biệt không ý nghĩa thống kê ở độ tinh cậy 95% nhưng độ Brix của dòng M.8.1 và M.6.2 có sự khác biệt rõ rệt (dòng M.8.1 là 28,73 và dòng M.6.2 là 22,93)
Vì vậy, dòng M.8.1 được chọn là dòng nấm mốc có khả năng đường hóa tốt nhất trong số các dòng đã phân lập và được sử dụng làm nguồn giống chủng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Với cùng một phương pháp bố trí thí nghiệm, dòng nấm mốc phân lập được trong viên men rượu theo Hà Phương Thảo (2013) (M.1.3 kí hiệu HAQ, Hải Anh Quang) cho thể tích dịch rỉ cao hơn (52,5ml) so với dòng nấm mốc M.8.1 phân lập được từ viên men cơm rượu (30,30ml), nhưng độ Brix của dòng nấm mốc M.8.1 (28,73oBrix) thì lại cao hơn rất nhiều so với dòng nấm mốc HAQ (23,9oBrix). Do vậy,
vẫn có thể sử dụng dòng mốc M.8.1 được tuyển chọn để ứng dụng sản xuất bột mốc cho quá trình đường hóa đạt hiệu suất cao.
4.3. Sản xuất bột mốc từ dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao
Dòng nấm mốc M.8.1 được tuyển chọn có hoạt tính đường hóa cao được sử dụng để nuôi tăng sinh khối nhằm mục đích sản xuất bột mốc thử nghiệm. Môi trường sử dụng để nuôi mốc là bắp mảnh và vỏ trấu với tỷ lệ 10%. Bắp mảnh là nguồn cung cấp tinh bột cho nấm mốc phát triển, vỏ trấu được bổ sung nhằm tạo độ thông thoáng cho khối mốc.
Bột mốc sau khi sản xuất được pha loãng và cấy trải trên môi trường Crapek Dox Broth để xác định mật số sau 24 - 48 giờ ủ ở 30oC.
Sau khi nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10-6 thì tính được mật số nấm mốc trong bột mốc đạt 9,09 log CFU/g (1,24x109 CFU/g), so với mật số nấm mốc trong một số viên men trên thị trường từ 5,93 đến 7,61 log CFU/g (Ngô Thị Phương Dung, 2010) và so với mật số nấm mốc là 6,74 log CFU/g từ bột mốc HAQ (Hải Anh Quang) (Hà Phương Thảo, 2013) thì mật số nấm mốc trong bột mốc M.8.1 là rất cao.
Mật số nấm mốc đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu đạt 7x109 bào tử/g, mật số nấm mốc khi đếm trực tiếp sẽ cao hơn so với đếm sống điều đó cho thấy đối với phương pháp đếm trực tiếp còn có cả những bào tử đã chết.
4.4. Hoạt tính đường hóa theo thời gian của các nghiệm thức bột mốc đã sản xuất
Bột mốc được xác định hoạt tính trên khối gạo sau khi hấp. Hoạt tính bột mốc được thể hiện qua việc quan sát sự phát triển của khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH, độ Brix và thể tích dịch rỉ sinh ra sau khi kết thúc giai đoạn đường hóa. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố là tỷ lệ bột mốc (1; 2; 3%) và thời gian ủ (2; 3; 4 ngày) ở 300C.
Bảng 5. Sự xuất hiện khuẩn ty theo tỷ lệ bột mốc và thời gian ủ
Tỷ lệ bột mốc
Xuất hiện khuẩn ty (ngày)
1 2 3 4
1% - + + +
2% - + + +
3% - + + +
Ghi chú: Khuẩn ty xuất hiện theo mức độ tăng dần từ ít (+) đến nhiều (++++)
không có dịch rỉ (-)
Bảng 6. Khả năng đường hóa của bột mốc theo tỷ lệ và thời gian ủ
Nghiệm thức Tổ hợp nghiệm thức Thể tích dịch rỉ (ml) Brix sau ủ pH Tỷ lệ bột mốc (%) Thời gian
ủ (ngày) Trước ủ Sau ủ
1 1 2 21,83d 29,03a 6,18 5,77a 2 1 3 30,00ab 29,00a 6,08 4,33d 3 1 4 32,00a 28,50c 6,10 4,33d 4 2 2 20,33d 28,90ab 6,13 4,37d 5 2 3 27,83bc 28,00d 6,15 4,33d 6 2 4 28,83b 27,93d 6,09 4,43cd 7 3 2 22,67d 28,77abc 6,17 5,27b 8 3 3 25,33c 28,67bc 6,09 4,57c 9 3 4 29,33b 27,93d 6,03 4,47cd CV(%) 3,47 0,4 1,23
Ghi chú: Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy là 95%.
Quan sát trên khối gạo hấp, sau 2 ngày ủ mốc hệ khuẩn ty nấm mốc xuất hiện thành những sợi nhỏ trên khối nếp và thành bình chứa nhưng rất ít.
Khuẩn ty phát triển rất ít sau 4 ngày ủ nhưng lượng dịch rỉ đã xuất hiện chỉ sau 1 ngày ủ ở tất cả các nghiệm thức và tăng dần theo thời gian ủ mốc. Sau 2 ngày ủ, khuẩn ty nấm mốc vẫn không thấy phát triển nhiều, dịch rỉ ướt cả khối nếp, nghiêng bình dịch rỉ chảy chậm, sánh và trong. Trộn đều khối gạo hấp sau ủ nhận thấy khối nếp trở nên rất mềm, dễ đảo trộn. Dịch rỉ sinh ra làm cho khối gạo hấp trở nên mềm hơn.
Quan sát sự phát triển của hệ khuẩn ty thì ta nhận thấy mặc dù với tỷ lệ chủng khác nhau là 1%, 2% và 3% nhưng sự phát triển của khuẩn ty thì tương đương nhau
giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên thể tích dịch rỉ sinh ra giữa các nghiệm thức thì có sự khác biệt.
Dựa trên kết quả thể tích dịch rỉ sinh ra thì lượng thể tích dịch rỉ ở cả ba tỷ lệ bột mốc 1%, 2%, 3% đều tăng theo thời gian ủ mốc. Kết quả sau ủ mốc thể tích dịch rỉ sinh ra ở 2 nghiệm thức 2 và 3 là cao nhất. Nghiệm thức (NT) 2 là 30ml khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% đối với NT 3 là 32ml và khác biệt có nghĩa đối với các nghiệm thức còn lại (NT 1: 21,83ml, NT 4: 20,33ml, NT 5: 27,83ml, NT 6: 28,83ml, NT 7: 22,67ml, NT 8: 25,33ml, NT 9: 29,3ml).
Theo kết quả cho thấy, độ Brix theo tỉ lệ bột mốc 1%, 2% và 3% đều giảm theo thời gian ủ. Sau 2 ngày ủ mốc, độ Brix rất cao và giảm dần sau 3 ngày, 4 ngày, nguyên nhân là thời gian đường hóa là giai đoạn ủ hở nên tạo điều kiện cho các vi sinh vật hiếu khí xâm nhiễm, các vi sinh vật có thể nhiễm vào từ nhiều nguồn như dụng cụ, không khí hoặc trực tiếp từ bột mốc đã sản xuất, đặc biệt là vi khuẩn sinh acid lactic, vi khuẩn sinh acid acetic thường gặp trong lên men rượu, các sản phẩm chuyển hóa của chúng như các acid hữu cơ có thể ảnh hưởng đến quá trình đường hóa và cũng là một phần nguyên nhân làm giảm giá trị pH. Bên cạnh đó, thời gian ủ càng dài thì cũng làm giảm sức sống của nấm mốc và đi kèm với sự gia tăng của các vi khuẩn không mong muốn làm cho hoạt tính tạo ra glucose và hoạt động của amyloseglucosidase sẽ giảm, làm giảm hàm lượng đường được sinh ra và do đó độ Brix cũng giảm dần khi vượt quá thời gian tối ưu cho quá trình đường hóa (Dung, 2004).
Kết quả sau ủ mốc, độ Brix ở NT 1 là 29,03, NT 2 là 29,00, NT 4 là 28,90 và NT 7 là 28,77, các nghiệm thức này có độ Brix khác biệt không ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% và có khác biệt nghĩa đối với các nghiệm thức còn lại (NT 3: 28,50, NT 5: 28,00, NT 6: 27,93, NT 8: 28,67 và NT 9: 27,93). Do đó, thời gian ủ mốc thích hợp để quá trình đường hóa cho độ Brix cao nhất là 2 - 3 ngày.
Giá trị pH của tất cả các nghiệm thức tỉ lệ bột mốc theo thời gian ủ đều giảm và ở trong khoảng từ 4,3 - 5,7, cho thấy sự lên men thành công của khối ủ và hạn chế được sự tạp nhiễm của các vi sinh vật gây chua.
Theo kết quả thống kê, NT 2 cho thể tích dịch rỉ cao nhất (30ml) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% so với NT 3 (32ml) nhưng độ Brix thì lại có khác biệt ý nghĩa (NT 2: 29,00, NT 3: 28,50).
Tóm lại, mức độ sử dụng bột mốc thấp và thời gian ủ ngắn nhưng thể tích dịch rỉ sinh ra và và độ Brix đạt được cao hơn so với mức độ sử dụng cao. Vì vậy, nghiệm thức tỉ lệ bột mốc 1% và thời gian đường hóa 3 ngày (NT 2) là tối ưu cho quá trình đường hóa.
So với bột mốc HAQ với mật số bào tử nấm mốc là 6,74 log CFU/g cho trung bình thể tích dịnh rỉ là 34,44ml và độ Brix là 29,51 (Hà Phương Thảo, 2013) cũng cùng thời gian ủ là 3 ngày và ở nhiệt độ 30oC thì bột mốc M.8.1 với mật số bào tử là 9,09 log CFU/g cho thể tích dịch rỉ và độ Brix thấp hơn nhưng không nhiều lần lượt là 30ml và 29oBrix. Điều này cho thấy bột mốc được sản xuất từ nấm mốc phân lập được ở 2 loại viên men khác nhau là viên men rượu và viên men cơm rượu sẽ cho hoạt tính khác nhau. Bột mốc được sản xuất từ dòng nấm mốc M.8.1 cho hoạt tính với thể tích dịch rỉ vừa phải, độ Brix cao, dịch đường sánh trong là rất phù hợp để sản xuất ra những viên cơm rượu thơm ngon và đạt chất lượng cao.
Khả năng đường hóa của bột mốc là một tiêu chí quan trọng để đánh giá hoạt tính của bột mốc, hoạt tính được thể hiện dựa trên thể tích dịch rỉ sinh ra và độ Brix của dịch rỉ.
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Phân lập được 22 dòng nấm mốc: M.1.1, M.1.2, M.2.1, M.2.2, M.3.1, M.3.2, M.4.1, M.4.2, M.5.1, M.5.2, M.6.1, M.6.2, M.7.1, M.7.2, M.8.1, M.8.2, M.9.1, M.9.2, M.10.1, M.10.2, M.11.1, M.11.2 có trong 11 loại men cơm rượu. Trong đó dòng nấm mốc M.8.1 cho hoạt tính đường hóa cao nhất thích hợp cho làm nguồn giống chủng sản xuất bột mốc.
- Bột mốc đã sản xuất có mật số nấm mốc đạt 9,09 log CFU/g.
- Nghiệm thức tỷ lệ bột mốc 1% và thời gian ủ 3 ngày cho thể tích dịch rỉ 30ml và 29oBrix cao nhất là tối ưu cho quá trình đường hóa.
5.2. Đề nghị
- Định danh các dòng nấm mốc phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Nghiên cứu các điều kiện bảo quản và tồn trữ sản phẩm bột mốc thuần.
- Nghiên cứu những điều kiện tối ưu cho nấm mốc, khả năng hoạt động của nấm mốc trong quá trình lên men chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt độ, nồng độ giống, thời gian ủ,…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Hà Phương Thảo. 2013. Phân lập, tuyển chọn và sản xuất thử nghiệm men rượu thuần
lên men rượu gạo. Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ thực phẩm, trường Đại học
Cần Thơ.
Ngô Thị Phương Dung. 2010. Nghiên cứu cải tiến qui trình sản xuất rượu lên men ở
vùng Đồng bằng song Cửu Long. Đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ. Trường
Đại học Cần Thơ.
Cao Ngọc Điệp. 2006. Giáo trình nấm học. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, trang 26-43.
Nguyễn Đức Lượng. 2002. Công nghệ vi sinh vật. tập 1. NXB. Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh.
Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế. 1999. Nấm mốc và phương pháp phòng chống. NXB.
Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, Việt Nam.
Bùi Xuân Đông. 2004. Nguyên lý phòng chống nấm mốc và Mycotoxin. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
Lương Đức Phẩm. 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Tiếng Anh
Brown, W. H. and Poon, T. 2005. Introduction to organic chemistry (3rd ed.). Wiley. Holzapel, W. 1997. Use of starter cultures in fermentation on a household scale. Food
control 8, pp. 241-258.
Lee, A.C. and Y. Fujio. 1998. Microflora of banh men, a fermentation starter from Vietnam. World Journal of Microbiology and Biotechnology 15, pp. 51-55
Arima K. 1964. Microbial Enzyme Production, In: Star, M.P. (ed) Applied Global Impacts, pp. 277-294, Wiley, New york.
Beckhorn E.J. 1967. Production of Microbial Enzymes, In Peppler, H.J. (ed)