a. Mục đích:
Thí nghiệm này nhằm mục đích để xác định tuyển chọn các dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao trước khi được sử dụng làm nguồn giống chủng.
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố (22 dòng nấm mốc từ 10 địa phương khác nhau được chọn từ thí nghiệm phân lập) và 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ:
Hình 11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc phân lập Ngâm (4 giờ, 30oC, tỷ lệ gạo: nước = 1: 1,2) Hấp 100oC, 1giờ Để nguội 35 - 40oC Chủng mốc thuần Ủ 30oC, 3 ngày Kiểm tra hoạt lực đường hóa
Xử lý sơ bộ Gạo (50g)
c. Cách tiến hành:
Chuẩn bị gạo hấp: cân 50g gạo cho vào bình tam giác loại 250ml, thêm vào 60ml nước cất, đậy bằng nút gòn và nắp giấy, ngâm 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm được hấp trong nồi hấp ở 100oC trong 1 giờ. Gạo đã hồ hóa được làm nguội đến 30 - 40oC.
Chuẩn bị giống chủng: nấm mốc lấy từ các ống giống được nuôi cấy trên môi trường PGA có bổ sung khoáng cần thiết ủ ở 30oC trong 2 - 3 ngày cho sinh bào tử. Sau đó dùng que cấy cạo khuẩn ty nấm mốc từ các đĩa petri cho vào bình tam giác chứa gạo đã hồ hóa (số lượng mốc chủng vào: 1 đĩa petri). Tiếp theo, dùng đũa thủy tinh trộn đều, tạo khoảng trống giữa khối gạo nhằm tạo điều kiện hiếu khí kích thích sự phát triển của nấm mốc và ủ 3 ngày ở 30oC.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, các thao tác theo nguyên tắc vô trùng. Kết thúc quá trình ủ, dịch đường sinh ra được thu hoạch bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4oC. d. Kết quả thu nhận - Sự phát triển khuẩn ty - Sự xuất hiện dịch rỉ - pH sau khi ủ mốc - Độ Brix sau ủ mốc - Thể tích dịch rỉ
3.2.3. Thử nghiệm sản xuất bột mốc có hoạt tính đường hóa cao a. Mục đích:
Sản xuất bột mốc thuần ở quy mô phòng thí nghiệm từ chủng nấm mốc thuần có hoạt tính đường hóa cao đã được tuyển chọn từ thí nghiệm trên.
b. Bố trí thí nghiệm
Thử nghiệm sản xuất bột mốc
Sơ đồ thí nghiệm:
Hình 12. Qui trình sản xuất bột mốc
(Nguồn: Ngô Thị Phương Dung, 2010) Ủ ở 30oC trong 4 ngày
Bổ sung khoáng, nước (tạo độ ấm 50%)
Để nguội 35 - 40oC Chủng mốc giống
Trộn khuẩn ty, bào tử mốc, bắp, trấu 90% Bắp mảnh + 10% trấu
Sấy ở 42oC/17 giờ
Xay thành bột
Bột mốc thuần Ủ 5 ngày, 30 - 32oC
Môi trường PGA Nấm mốc thuần được chọn
từ thí nghiệm 2
Hấp khử trùng 100oC, 1 giờ Ngâm 1 giờ
c. Cách tiến hành
Chuẩn bị mốc giống: Mốc giống được nuôi cấy trên môi trường PGA trong đĩa petri ủ 5 ngày ở 30oC, cho nước muối sinh lý 0,85% để thu bào tử và khuẩn ty.
Cân 200g cơ chất (10% trấu và 90% bắp mảnh), nhuyễn cho vào bọc PP (polypropylen) kích thước 35 x 55cm, bổ sung khoáng (NH4)2SO4 0,2%, KH2PO4
0,1%, MgSO4 0,05%, CaSO4 0,02% và nước muối sinh lý 0,85% 100ml (tạo độ ẩm 50%). Ngâm 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hấp khử trùng 100oC, 1 giờ và để nguội 35 - 40oC.
Chủng nấm mốc: dùng kim cấy cạo lớp khuẩn ty trên bề mặt đĩa petri vào ống nghiệm chứa dung dịch nước muối sinh lý 0,85% sao cho đạt mật số bào tử là 106 bào tử/ml. Chủng 20ml dịch huyền phù nấm mốc vào hỗn hợp cơ chất và trộn đều. Dùng que cấy đã khử trùng xôm những lỗ nhỏ trên bọc chứa môi trường. Tiến hành ủ mốc 4 ngày ở 30oC. Thu hoạch khối mốc đã ủ, đánh tơi bằng que inox đã khử trùng, sấy ở 42oC trong 17 giờ. Xay nhỏ thành bột. Thu hoạch bột mốc thuần, trữ trong bao bì PP ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Xác định mật số nấm mốc có trong bột mốc
Sử dụng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
Sử dụng phương pháp đếm sống trên môi trường Crapek Dox Broth có
bổ sung agar.
Cách thực hiện: cân 1g bột nấm mốc cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch
nước muối sinh lí 0,85% đã khử trùng, đồng hóa bằng máy Vortex. Sau đó pha loãng nhiều lần bằng cách hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 0,85% đã khử trùng. Và tiếp tục như vậy để pha loãng mẫu với các nồng độ khác nhau. Chọn 4 nồng độ pha loãng liên tiếp thích hợp là 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 đếm mật số nấm mốc. Cấy 1μl dung dịch trên môi trường Crapek Dox Broth có bổ sung agar (môi trường nuôi cấy vi sinh vật trình bày trong phần phụ chương) và tiến hành trãi mẫu trên đĩa môi trường và đếm khuẩn lạc nấm mốc sau 24 đến 48 giờ ủ ở 30oC.
3.2.4. Khảo sát hoạt tính bột mốc a. Mục đích: a. Mục đích:
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại.
Nhân tố 1: Tỷ lệ bột mốc (1, 2, 3%)
Nhân tố 2: Thời gian ủ mốc (2, 3, 4 ngày)
Số nghiệm thức là: 3 x 3 = 9, 9 x 3 lần lặp lại = 27 ĐVTN ( đơn vị thí nghiệm).
Sơ đồ thí nghiệm:
A1, A2, A3 : Theo thứ tự là tỷ lệ bột mốc 1%, 2% và 3%. B1, B2, B3 : Theo thứ tự là thời gian ủ mốc 2, 3, 4 ngày.
Hình 13. Sơ đồ thử hoạt tính của bột mốc khảo sát trên môi trường gạo hấp.
Thử hoạt tính bột mốc: Hoạt tính của bột mốc được khảo sát trên môi trường gạo hấp. Cân 50g gạo cho vào bình tam giác (conical flask) loại 250ml, thêm vào 60ml nước cất, đậy bằng nút gòn và nắp giấy, ngâm 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm được hấp trong nồi hấp (autoclave) ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Gạo đã đồ hóa được làm nguội đến 30 - 40oC. Lấy tỷ lệ bột mốc phù hợp như thí nghiệm đã bố trí theo 3 nghiệm thức trên vào mỗi bình, ủ ở 30oC trong thời gian đường hóa của thí nghiệm.
Để nguội 35 - 40oC 50 g gạo hấp Chủng tỷ lệ bột mốc Phân tích các chỉ tiêu B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 Ủ hiếu khí (30oC) A1 A2 A3
Phân tích các chỉ tiêu: Sự phát triển khuẩn ty Sự xuất hiện dịch rỉ pH sau ủ mốc Độ Brix sau ủ mốc Thể tích dịch rỉ 3.3. Phương pháp phân tích
Dùng phần mềm Microsoft Excel để nhập, xử ly số liệu và phần mềm thống kê Minitab 16.0 để phân tích ANOVA và so sánh các giá trị trung bình.
3.3.1. Khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc phân lập
- Quan sát sự phát triển của hệ khuẩn ty nấm mốc và sự rò rỉ nước dịch từ khối nếp lên men, mỗi lần quan sát cách nhau 24 giờ.
- Xác định pH bằng pH kế (Sartorius, PB-20, Đức): nếp sau 4 giờ ngâm, dịch rỉ đường sinh ra sau thời gian ủ mốc (3 ngày).
- Xác định độ Brix bằng khúc xạ kế (Hand Refractometer, FG103/113, Euromex - Hà Lan).
- Xác định thể tích dịch rỉ bằng phương pháp ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC (Hettich- Zentrifligen, 4810, Đức).
3.3.2. Thử nghiệm sản xuất bột mốc thuần
Xác định mật số bào tử nấm mốc trong bột mốc bằng phương pháp trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu và phương pháp đếm sống trên môi trường Crapek Dox Broth có bổ sung agar (xem phụ lục 2).
3.3.3. Xác định hoạt tính của bột mốc
Xác định hoạt tính bột mốc tương tự như xác định khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc phân lập ở mục 3.3.1.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập nấm mốc
Kết quả phân lập được 22 dòng nấm mốc từ 11 loại men cơm rượu ở 10 địa điểm khác nhau. Kí hiệu của các dòng mốc là M.i.j trong đó M.i là kí hiệu loại men (đã trình bày ở Bảng 1) và j là thứ tự phân lập. Các dòng nấm mốc phân lập được quan sát mỗi ngày để theo dõi đặc điểm và sự phát triển của chúng bằng kính lúp (tất cả ảnh chụp sau 3 ngày nuôi cấy, ủ ở 30oC). Kết quả quan sát như sau:
Bảng 2. Đặc điểm của các dòng nấm mốc phân lập
Dòng nấm mốc Đặc điểm của các dòng nấm mốc
M.1.1 Khuẩn ty rất phát triển sau 24 giờ, có màu trắng, hệ sợi mỏng, khuẩn ty thấp có màu trắng. Sau 48 giờ có thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.1.2 Khuẩn ty mọc sát bề mặt môi trường, không nhìn thấy hệ sợi, sau 48 giờ phát triển thành lớp màng màu trắng đục, sau 3 ngày nuôi, không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.2.1 Khuẩn ty phát triển mạnh, sau 1 ngày nuôi cấy hệ sợi đã phát triển, sợi khuẩn ty mọc lan ra, có màu trắng. Sau 48 giờ, hệ sợi phát triển ra khắp đĩa. Và sau 72 giờ, khuẩn ty phát triển thành một lớp màng bông dày.
M.2.2 Sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn ty phát triển mạnh, có bào tử xuất hiện khắp đĩa, sinh bào tử rất nhiều, bào tử li ti như hạt bụi. Sau 72 giờ, khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa và có màu vàng nâu.
M.3.1 Khuẩn ty phát triển ít sau 24 giờ, có màu trắng, khuẩn ty mọc lan ra toàn đĩa thành hệ sợi bông như mạng nhện. Sau 48 giờ, khuẩn ty phát triển mạnh hơn và thành một hệ sợi màu trắng.
M.3.2 Sau 24 giờ ủ, khuẩn ty phát triển thẳng và phát triển rất mạnh, mọc khắp đĩa và gần đụng nắp đĩa, có màu trắng và chưa thấy xuất hiện bào tử. Sau 48 giờ bắt đầu xuất hiện các hạt bào tử nhỏ li ti màu đen như hạt bụi và sau 72 giờ khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa, có màu xám.
M.4.1 Khuẩn ty phát triển chậm sau 24 giờ, phát triển thành khối bông có màu trắng, sợi khuẩn ty mọc thưa, mọc sát đĩa. Sau 48 giờ, khuẩn ty mọc khắp đĩa tạo thành một mảng bông mỏng có màu trắng.
M.4.2 Khuẩn ty phát triển rất mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn ty phát triển thành khối bông tới mặt đĩa, mọc kín mặt đĩa và bắt đầu xuất hiện bào tử. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện rất nhiều, sợi nấm mỏng và bào tử cũng nhỏ như hạt bụi.
M.5.1 Khuẩn ty rất ít phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty thấp có màu trắng, sau 2 ngày khuẩn ty phát triển thành lớp màng phủ kín mặt đĩa, khuẩn ty có dạng sợi bông mọc sát đĩa. Sau 72 giờ, tạo thành lớp màng bông màu trắng và không thể quan sát bào tử bằng mắt thường.
M.5.2 Khuẩn ty phát triển rất nhiều sau 24 giờ. Sau 48 giờ khuẩn ty mọc kín mặt đĩa và bắt đầu xuất hiện bào tử, khuẩn ty mọc rất dày và có màu trắng. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện nhiều và có màu đen.
M.6.1 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ nuôi cấy, có màu trắng. Sau 2 ngày cấy khuẩn ty phát triển thành một mảng nhung xung quanh chỗ cấy và từ từ lan ra khắp đĩa.
M.6.2 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, sợi khuẩn ty màu trắng và có bào tử nhỏ màu đen xuất hiện. Hệ khuẩn ty phát triển rất mạnh, chỉ sau 48 giờ, đã mọc đầy khắp đĩa và đụng tới nắp đĩa. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện nhiều hơn và làm cho đĩa chuyển sang màu nâu đen.
M.7.1 Khuẩn ty phát triển thành hệ sợi màu trắng sát đĩa sau 24 giờ nuôi cấy và sau đó lan ra khắp đĩa sau 48 giờ. Sau 72 giờ, khuẩn ty tạo thành lớp màng mỏng sát bề mặt môi trường và không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.7.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty mọc dày như mạng nhện, cao đụng mặt đĩa và sinh bào tử sau 48 giờ. Khuẩn ty chuyển sang màu xám và sinh rất nhiều các hạt bào tử màu đen nhỏ li ti.
M.8.1 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, tạo thành khối bông màu trắng đường kính khoảng 3,5cm, sau 48 giờ khuẩn ty lan ra khắp đĩa, có màu trắng toàn đĩa và không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt.
M.8.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ nuôi cấy, sau 2 ngày thì khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa, sợi khuẩn ty mọc thằng, bào tử đen xuất hiện. Sau 48 giờ, bào tử đen xuất hiện đều khắp toàn đĩa.
M.9.1 Khuẩn ty phát triển ít sau 24 giờ, khuẩn ty thấp và lan ra khắp đĩa, có màu trắng. Sau 48 giờ, hệ sợi phát triển nhiều hơn và hướng ra ngoài đĩa. Sau 72 giờ, khuẩn ty phát triển mạnh và thành một mảng sợi trắng.
M.9.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty có độ dày trung bình lan rộng kín bề mặt môi trường và tạo thành hệ sợi dày sắp tới mặt đĩa, sau 72 giờ xuất hiện bào tử có màu vàng nâu.
M.10.1 Khuẩn ty mọc sát bề mặt môi trường, hệ sợi phát triển ít, màu trắng, phát triển khắp bề mặt môi trường. Sau 48 giờ, khuẩn ty mọc thành một mảng sợi thấp sát bề mặt và khó nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.10.2 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 1 ngày nuôi cấy, sau 48 giờ khuẩn ty mọc đầy đĩa bào tử xuất hiện là những hạt tròn nhỏ li ti màu đen.
M.11.1 Sau 24 giờ ủ, khuẩn ty phát triển thành một mảng có hệ sợi bông có màu trắng. Sau 3 ngày thì khuẩn ty mọc lan ra khắp đĩa nhưng hệ sợi phát triển rất kém và luôn mọc sát bề mặt môi trường tạo thành một màng sợi mỏng có màu trắng ngà.
M.11.2 Khuẩn ty mọc rất nhanh sau 24 giờ ủ, sợi khuẩn ty mọc thẳng đụng tới mặt đĩa và có màu trắng. Sau 72 giờ, sinh bào tử rất nhiều và khuẩn ty trở nên rất mềm, mỏng và quan sát bằng mắt gần như trong suốt nhìn thấy bào tử đen li ti rất rõ.
Hình ảnh một số dòng nấm mốc phân lập được:
Hình 14. Một số dòng nấm mốc phân lập
4.2. Tuyển chọn các dòng nấm mốc phân lập có hoạt tính đường hóa cao
Thí nghiệm sử dụng nguồn giống chủng là các dòng nấm mốc đã được phân lập từ 11 loại men khác nhau nuôi cấy trên môi trường PGA có bổ sung khoáng cần thiết sau 3 ngày ủ ở 30oC cho sinh bào tử và được đường hóa trên khối gạo hấp. Hoạt tính nấm mốc được xác định thông qua sự phát triển của khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH, độ Brix và thể tích dịch rỉ sau 3 ngày ủ mốc ở 30oC. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3 và 4.
Bảng 3. Sự xuất hiện khuẩn ty của các dòng nấm mốc đã phân lập
STT Dòng
nấm mốc
Sự xuất hiện khuẩn ty (ngày)
1 2 3 1 M.1.1 - + ++ 2 M.1.2 + ++ +++ 3 M.2.1 + ++ +++ 4 M.2.2 + ++ ++ 5 M.3.1 - + ++ 6 M.3.2 ++ +++ ++++ 7 M.4.1 - ++ +++ 8 M.4.2 + ++ +++ 9 M.5.1 ++ +++ ++++ 10 M.5.2 + + ++ 11 M.6.1 - + ++ 12 M.6.2 + ++ +++ 13 M.7.1 - + ++ 14 M.7.2 ++ +++ ++++ 15 M.8.1 + ++ +++ 16 M.8.2 ++ +++ ++++ 17 M.9.1 - + ++ 18 M.9.2 ++ +++ ++++ 19 M.10.1 - + ++ 20 M.10.2 ++ ++ +++ 21 M.11.1 + + ++ 22 M.11.2 + + +++ ++++
Ghi chú: Khuẩn ty xuất hiện theo mức độ tăng dần từ ít (+) đến nhiều (++++)
Bảng 4. Khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc STT Dòng nấm mốc Thể tích dịch rỉ (ml) Độ Brix sau ủ mốc pH Trước ủ Sau ủ 1 M.1.1 21,07ij 28,63ab 6,12 4,87b 2 M.1.2 25,33c 28,10ab 6,11 4,53ef 3 M.2.1 23,13efg 28,00ab 5,83 3,96h 4 M.2.2 24,03de 28,00ab 6,08 4,46f 5 M.3.1 22,27gh 28,57ab 6,25 5,19a 6 M.3.2 18,30k 22,10hi 5,84 3,44k 7 M.4.1 23,70def 28,60ab 5,98 4,91b 8 M.4.2 20,07j 23,93f 5,69 3,73ij 9 M.5.1 22,33gh 21,60i 5,72 3,40k 10 M.5.2 28,33b 25,33e 6,01 4,28g 11 M.6.1 21,60hi 28,43ab 6,28 4,81bc 12 M.6.2 30,90a 22,93gh 5,88 3,82hi 13 M.7.1 23,67def 27,70bc 6,31 4,70cd 14 M.7.2 18,47k 24,47ef 5,48 3,75ij 15 M.8.1 30,30a 28,73a 6,26 4,61def 16 M.8.2 22,47gh 24,70ef 6,03 3,68ij 17 M.9.1 24,33cd 28,20ab 6,26 4,49ef 18 M.9.2 17,60k 23,83fg 6,11 3,63j 19 M.10.1 22,67fgh 27,73bc 6,27 4,62de 20 M.10.2 17,37k 21,67i 5,91 3,67ij 21 M.11.1 28,03b 26,33d 6,02 4,52ef