a. Mục đích:
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại.
Nhân tố 1: Tỷ lệ bột mốc (1, 2, 3%)
Nhân tố 2: Thời gian ủ mốc (2, 3, 4 ngày)
Số nghiệm thức là: 3 x 3 = 9, 9 x 3 lần lặp lại = 27 ĐVTN ( đơn vị thí nghiệm).
Sơ đồ thí nghiệm:
A1, A2, A3 : Theo thứ tự là tỷ lệ bột mốc 1%, 2% và 3%. B1, B2, B3 : Theo thứ tự là thời gian ủ mốc 2, 3, 4 ngày.
Hình 13. Sơ đồ thử hoạt tính của bột mốc khảo sát trên môi trường gạo hấp.
Thử hoạt tính bột mốc: Hoạt tính của bột mốc được khảo sát trên môi trường gạo hấp. Cân 50g gạo cho vào bình tam giác (conical flask) loại 250ml, thêm vào 60ml nước cất, đậy bằng nút gòn và nắp giấy, ngâm 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm được hấp trong nồi hấp (autoclave) ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Gạo đã đồ hóa được làm nguội đến 30 - 40oC. Lấy tỷ lệ bột mốc phù hợp như thí nghiệm đã bố trí theo 3 nghiệm thức trên vào mỗi bình, ủ ở 30oC trong thời gian đường hóa của thí nghiệm.
Để nguội 35 - 40oC 50 g gạo hấp Chủng tỷ lệ bột mốc Phân tích các chỉ tiêu B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 Ủ hiếu khí (30oC) A1 A2 A3
Phân tích các chỉ tiêu: Sự phát triển khuẩn ty Sự xuất hiện dịch rỉ pH sau ủ mốc Độ Brix sau ủ mốc Thể tích dịch rỉ 3.3. Phương pháp phân tích
Dùng phần mềm Microsoft Excel để nhập, xử ly số liệu và phần mềm thống kê Minitab 16.0 để phân tích ANOVA và so sánh các giá trị trung bình.
3.3.1. Khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc phân lập
- Quan sát sự phát triển của hệ khuẩn ty nấm mốc và sự rò rỉ nước dịch từ khối nếp lên men, mỗi lần quan sát cách nhau 24 giờ.
- Xác định pH bằng pH kế (Sartorius, PB-20, Đức): nếp sau 4 giờ ngâm, dịch rỉ đường sinh ra sau thời gian ủ mốc (3 ngày).
- Xác định độ Brix bằng khúc xạ kế (Hand Refractometer, FG103/113, Euromex - Hà Lan).
- Xác định thể tích dịch rỉ bằng phương pháp ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC (Hettich- Zentrifligen, 4810, Đức).
3.3.2. Thử nghiệm sản xuất bột mốc thuần
Xác định mật số bào tử nấm mốc trong bột mốc bằng phương pháp trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu và phương pháp đếm sống trên môi trường Crapek Dox Broth có bổ sung agar (xem phụ lục 2).
3.3.3. Xác định hoạt tính của bột mốc
Xác định hoạt tính bột mốc tương tự như xác định khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc phân lập ở mục 3.3.1.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập nấm mốc
Kết quả phân lập được 22 dòng nấm mốc từ 11 loại men cơm rượu ở 10 địa điểm khác nhau. Kí hiệu của các dòng mốc là M.i.j trong đó M.i là kí hiệu loại men (đã trình bày ở Bảng 1) và j là thứ tự phân lập. Các dòng nấm mốc phân lập được quan sát mỗi ngày để theo dõi đặc điểm và sự phát triển của chúng bằng kính lúp (tất cả ảnh chụp sau 3 ngày nuôi cấy, ủ ở 30oC). Kết quả quan sát như sau:
Bảng 2. Đặc điểm của các dòng nấm mốc phân lập
Dòng nấm mốc Đặc điểm của các dòng nấm mốc
M.1.1 Khuẩn ty rất phát triển sau 24 giờ, có màu trắng, hệ sợi mỏng, khuẩn ty thấp có màu trắng. Sau 48 giờ có thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.1.2 Khuẩn ty mọc sát bề mặt môi trường, không nhìn thấy hệ sợi, sau 48 giờ phát triển thành lớp màng màu trắng đục, sau 3 ngày nuôi, không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.2.1 Khuẩn ty phát triển mạnh, sau 1 ngày nuôi cấy hệ sợi đã phát triển, sợi khuẩn ty mọc lan ra, có màu trắng. Sau 48 giờ, hệ sợi phát triển ra khắp đĩa. Và sau 72 giờ, khuẩn ty phát triển thành một lớp màng bông dày.
M.2.2 Sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn ty phát triển mạnh, có bào tử xuất hiện khắp đĩa, sinh bào tử rất nhiều, bào tử li ti như hạt bụi. Sau 72 giờ, khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa và có màu vàng nâu.
M.3.1 Khuẩn ty phát triển ít sau 24 giờ, có màu trắng, khuẩn ty mọc lan ra toàn đĩa thành hệ sợi bông như mạng nhện. Sau 48 giờ, khuẩn ty phát triển mạnh hơn và thành một hệ sợi màu trắng.
M.3.2 Sau 24 giờ ủ, khuẩn ty phát triển thẳng và phát triển rất mạnh, mọc khắp đĩa và gần đụng nắp đĩa, có màu trắng và chưa thấy xuất hiện bào tử. Sau 48 giờ bắt đầu xuất hiện các hạt bào tử nhỏ li ti màu đen như hạt bụi và sau 72 giờ khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa, có màu xám.
M.4.1 Khuẩn ty phát triển chậm sau 24 giờ, phát triển thành khối bông có màu trắng, sợi khuẩn ty mọc thưa, mọc sát đĩa. Sau 48 giờ, khuẩn ty mọc khắp đĩa tạo thành một mảng bông mỏng có màu trắng.
M.4.2 Khuẩn ty phát triển rất mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn ty phát triển thành khối bông tới mặt đĩa, mọc kín mặt đĩa và bắt đầu xuất hiện bào tử. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện rất nhiều, sợi nấm mỏng và bào tử cũng nhỏ như hạt bụi.
M.5.1 Khuẩn ty rất ít phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty thấp có màu trắng, sau 2 ngày khuẩn ty phát triển thành lớp màng phủ kín mặt đĩa, khuẩn ty có dạng sợi bông mọc sát đĩa. Sau 72 giờ, tạo thành lớp màng bông màu trắng và không thể quan sát bào tử bằng mắt thường.
M.5.2 Khuẩn ty phát triển rất nhiều sau 24 giờ. Sau 48 giờ khuẩn ty mọc kín mặt đĩa và bắt đầu xuất hiện bào tử, khuẩn ty mọc rất dày và có màu trắng. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện nhiều và có màu đen.
M.6.1 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ nuôi cấy, có màu trắng. Sau 2 ngày cấy khuẩn ty phát triển thành một mảng nhung xung quanh chỗ cấy và từ từ lan ra khắp đĩa.
M.6.2 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, sợi khuẩn ty màu trắng và có bào tử nhỏ màu đen xuất hiện. Hệ khuẩn ty phát triển rất mạnh, chỉ sau 48 giờ, đã mọc đầy khắp đĩa và đụng tới nắp đĩa. Sau 72 giờ, bào tử xuất hiện nhiều hơn và làm cho đĩa chuyển sang màu nâu đen.
M.7.1 Khuẩn ty phát triển thành hệ sợi màu trắng sát đĩa sau 24 giờ nuôi cấy và sau đó lan ra khắp đĩa sau 48 giờ. Sau 72 giờ, khuẩn ty tạo thành lớp màng mỏng sát bề mặt môi trường và không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.7.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty mọc dày như mạng nhện, cao đụng mặt đĩa và sinh bào tử sau 48 giờ. Khuẩn ty chuyển sang màu xám và sinh rất nhiều các hạt bào tử màu đen nhỏ li ti.
M.8.1 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 24 giờ nuôi cấy, tạo thành khối bông màu trắng đường kính khoảng 3,5cm, sau 48 giờ khuẩn ty lan ra khắp đĩa, có màu trắng toàn đĩa và không thể nhìn thấy bào tử bằng mắt.
M.8.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ nuôi cấy, sau 2 ngày thì khuẩn ty mọc đụng nắp đĩa, sợi khuẩn ty mọc thằng, bào tử đen xuất hiện. Sau 48 giờ, bào tử đen xuất hiện đều khắp toàn đĩa.
M.9.1 Khuẩn ty phát triển ít sau 24 giờ, khuẩn ty thấp và lan ra khắp đĩa, có màu trắng. Sau 48 giờ, hệ sợi phát triển nhiều hơn và hướng ra ngoài đĩa. Sau 72 giờ, khuẩn ty phát triển mạnh và thành một mảng sợi trắng.
M.9.2 Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ, khuẩn ty có độ dày trung bình lan rộng kín bề mặt môi trường và tạo thành hệ sợi dày sắp tới mặt đĩa, sau 72 giờ xuất hiện bào tử có màu vàng nâu.
M.10.1 Khuẩn ty mọc sát bề mặt môi trường, hệ sợi phát triển ít, màu trắng, phát triển khắp bề mặt môi trường. Sau 48 giờ, khuẩn ty mọc thành một mảng sợi thấp sát bề mặt và khó nhìn thấy bào tử bằng mắt thường.
M.10.2 Khuẩn ty phát triển mạnh sau 1 ngày nuôi cấy, sau 48 giờ khuẩn ty mọc đầy đĩa bào tử xuất hiện là những hạt tròn nhỏ li ti màu đen.
M.11.1 Sau 24 giờ ủ, khuẩn ty phát triển thành một mảng có hệ sợi bông có màu trắng. Sau 3 ngày thì khuẩn ty mọc lan ra khắp đĩa nhưng hệ sợi phát triển rất kém và luôn mọc sát bề mặt môi trường tạo thành một màng sợi mỏng có màu trắng ngà.
M.11.2 Khuẩn ty mọc rất nhanh sau 24 giờ ủ, sợi khuẩn ty mọc thẳng đụng tới mặt đĩa và có màu trắng. Sau 72 giờ, sinh bào tử rất nhiều và khuẩn ty trở nên rất mềm, mỏng và quan sát bằng mắt gần như trong suốt nhìn thấy bào tử đen li ti rất rõ.
Hình ảnh một số dòng nấm mốc phân lập được:
Hình 14. Một số dòng nấm mốc phân lập
4.2. Tuyển chọn các dòng nấm mốc phân lập có hoạt tính đường hóa cao
Thí nghiệm sử dụng nguồn giống chủng là các dòng nấm mốc đã được phân lập từ 11 loại men khác nhau nuôi cấy trên môi trường PGA có bổ sung khoáng cần thiết sau 3 ngày ủ ở 30oC cho sinh bào tử và được đường hóa trên khối gạo hấp. Hoạt tính nấm mốc được xác định thông qua sự phát triển của khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH, độ Brix và thể tích dịch rỉ sau 3 ngày ủ mốc ở 30oC. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3 và 4.
Bảng 3. Sự xuất hiện khuẩn ty của các dòng nấm mốc đã phân lập
STT Dòng
nấm mốc
Sự xuất hiện khuẩn ty (ngày)
1 2 3 1 M.1.1 - + ++ 2 M.1.2 + ++ +++ 3 M.2.1 + ++ +++ 4 M.2.2 + ++ ++ 5 M.3.1 - + ++ 6 M.3.2 ++ +++ ++++ 7 M.4.1 - ++ +++ 8 M.4.2 + ++ +++ 9 M.5.1 ++ +++ ++++ 10 M.5.2 + + ++ 11 M.6.1 - + ++ 12 M.6.2 + ++ +++ 13 M.7.1 - + ++ 14 M.7.2 ++ +++ ++++ 15 M.8.1 + ++ +++ 16 M.8.2 ++ +++ ++++ 17 M.9.1 - + ++ 18 M.9.2 ++ +++ ++++ 19 M.10.1 - + ++ 20 M.10.2 ++ ++ +++ 21 M.11.1 + + ++ 22 M.11.2 + + +++ ++++
Ghi chú: Khuẩn ty xuất hiện theo mức độ tăng dần từ ít (+) đến nhiều (++++)
Bảng 4. Khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc STT Dòng nấm mốc Thể tích dịch rỉ (ml) Độ Brix sau ủ mốc pH Trước ủ Sau ủ 1 M.1.1 21,07ij 28,63ab 6,12 4,87b 2 M.1.2 25,33c 28,10ab 6,11 4,53ef 3 M.2.1 23,13efg 28,00ab 5,83 3,96h 4 M.2.2 24,03de 28,00ab 6,08 4,46f 5 M.3.1 22,27gh 28,57ab 6,25 5,19a 6 M.3.2 18,30k 22,10hi 5,84 3,44k 7 M.4.1 23,70def 28,60ab 5,98 4,91b 8 M.4.2 20,07j 23,93f 5,69 3,73ij 9 M.5.1 22,33gh 21,60i 5,72 3,40k 10 M.5.2 28,33b 25,33e 6,01 4,28g 11 M.6.1 21,60hi 28,43ab 6,28 4,81bc 12 M.6.2 30,90a 22,93gh 5,88 3,82hi 13 M.7.1 23,67def 27,70bc 6,31 4,70cd 14 M.7.2 18,47k 24,47ef 5,48 3,75ij 15 M.8.1 30,30a 28,73a 6,26 4,61def 16 M.8.2 22,47gh 24,70ef 6,03 3,68ij 17 M.9.1 24,33cd 28,20ab 6,26 4,49ef 18 M.9.2 17,60k 23,83fg 6,11 3,63j 19 M.10.1 22,67fgh 27,73bc 6,27 4,62de 20 M.10.2 17,37k 21,67i 5,91 3,67ij 21 M.11.1 28,03b 26,33d 6,02 4,52ef 22 M.11.2 21,67hi 26,80cd 6,05 3,80i CV (%) 3,14 2,19 2,29
Ghi chú: Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy là 95%.
Sự xuất hiện của khuẩn ty và dịch rỉ tăng dần theo thời gian trong quá trình ủ mốc. Các dòng nấm mốc M.3.2, M.4.2, M.5.1, M.7.2, M.8.2, M.9.2, M.10.2, M.11.2 khuẩn ty phát triển khá mạnh sau 1 ngày ủ mốc, khuẩn ty lan rộng dày đặc khắp khối gạo hấp trong bình tam giác và sau 2 ngày ủ bắt đầu xuất hiện dịch rỉ nhưng rất ít, ở các dòng nấm mốc này hạt cơm hầu như còn nguyên, nước giữ lại tạo thành khối cháo đặc. Ở các dòng mốc M.5.2, M.6.2, M.8.1, M.11.1 không thấy sự phát triển nhiều của hệ khuẩn ty, nhưng sau 1 ngày ủ đã thấy xuất hiện dịch rỉ và lượng dịch rỉ này gia tăng
theo thời gian ủ, dịch thủy phân dạng trong, sau khi tách dung dịch thủy phân ra, phần xác xốp rời không dính với nhau. Các dòng nấm mốc còn lại dịch thủy phân hơi đục, sau khi tách dịch thủy phân, phần xác nhão dính bết vào nhau.
Qua đó ta có thể nhận thấy trong 22 dòng nấm mốc trên có 2 đặc tính khác nhau: một là theo hướng sinh ra enzyme (M.1.1, M.1.2, M.2.1, M.2.2, M.3.1, M.4.1, M.5.2, M.6.1, M.6.2, M.7.1, M.8.1, M.9.1, M.10.1, M.11.1), còn một dạng là theo hướng phát triển sinh khối (các dòng M.3.2, M.4.2, M.5.1, M.7.2, M.8.2, M.9.2, M.10.2, M.11.2).
Sau 3 ngày ủ giá trị pH đã giảm xuống khoảng từ 6 xuống còn 3,4 - 5,0. pH là một trong những chỉ tiêu đánh giá sự thành công của quá trình lên men khối mốc ủ vì nếu bị tạp nhiễm bởi các vi khuẩn có hại (thường là vi khuẩn gây chua) thì giá trị pH thường giảm thấp một cách đáng kể chỉ còn khoảng 3,0 (Lê Hoàng Thanh Tuấn, 2012)
Kết quả xử lý thống kê cho thấy trong số 22 dòng mốc thì có dòng mốc M.8.1 từ An Giang là có khả năng đường hóa mạnh nhất. Quan sát khả năng đường hóa theo 3 ngày ủ thì nhận thấy khuẩn ty của dòng M.8.1 tuy phát triển ít hơn so với các dòng khác nhưng lại cho hoạt tính đường hóa rất cao.
Dịch rỉ xuất hiện nhiều vào ngày thứ 2 và càng tăng lên ở ngày thứ 3. Dịch rỉ của dòng M.8.1 sánh đặc và trong.
Sau 3 ngày ủ mốc lượng dịch rỉ của dòng M.6.2 (30,9ml) và dòng M.8.1 (30,3ml) sinh ra nhiều và khác biệt không ý nghĩa thống kê ở độ tinh cậy 95% nhưng độ Brix của dòng M.8.1 và M.6.2 có sự khác biệt rõ rệt (dòng M.8.1 là 28,73 và dòng M.6.2 là 22,93)
Vì vậy, dòng M.8.1 được chọn là dòng nấm mốc có khả năng đường hóa tốt nhất trong số các dòng đã phân lập và được sử dụng làm nguồn giống chủng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Với cùng một phương pháp bố trí thí nghiệm, dòng nấm mốc phân lập được trong viên men rượu theo Hà Phương Thảo (2013) (M.1.3 kí hiệu HAQ, Hải Anh Quang) cho thể tích dịch rỉ cao hơn (52,5ml) so với dòng nấm mốc M.8.1 phân lập được từ viên men cơm rượu (30,30ml), nhưng độ Brix của dòng nấm mốc M.8.1 (28,73oBrix) thì lại cao hơn rất nhiều so với dòng nấm mốc HAQ (23,9oBrix). Do vậy,
vẫn có thể sử dụng dòng mốc M.8.1 được tuyển chọn để ứng dụng sản xuất bột mốc cho quá trình đường hóa đạt hiệu suất cao.
4.3. Sản xuất bột mốc từ dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao
Dòng nấm mốc M.8.1 được tuyển chọn có hoạt tính đường hóa cao được sử dụng để nuôi tăng sinh khối nhằm mục đích sản xuất bột mốc thử nghiệm. Môi trường sử dụng để nuôi mốc là bắp mảnh và vỏ trấu với tỷ lệ 10%. Bắp mảnh là nguồn cung cấp tinh bột cho nấm mốc phát triển, vỏ trấu được bổ sung nhằm tạo độ thông thoáng cho khối mốc.
Bột mốc sau khi sản xuất được pha loãng và cấy trải trên môi trường Crapek Dox Broth để xác định mật số sau 24 - 48 giờ ủ ở 30oC.
Sau khi nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10-6 thì tính được mật số nấm mốc trong bột mốc đạt 9,09 log CFU/g (1,24x109 CFU/g), so với mật số nấm mốc trong một số viên men trên thị trường từ 5,93 đến 7,61 log CFU/g (Ngô Thị Phương Dung, 2010) và so với mật số nấm mốc là 6,74 log CFU/g từ bột mốc HAQ (Hải Anh Quang) (Hà Phương Thảo, 2013) thì mật số nấm mốc trong bột mốc M.8.1 là rất cao.
Mật số nấm mốc đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu đạt 7x109 bào tử/g, mật số nấm mốc khi đếm trực tiếp sẽ cao hơn so với đếm sống điều đó cho thấy đối với phương pháp đếm trực tiếp còn có cả những bào tử đã chết.
4.4. Hoạt tính đường hóa theo thời gian của các nghiệm thức bột mốc đã sản xuất