2. 3.2 Các đặc tính của tinh dịch
3.2Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sau để đánh giá phẩm chất tinh dịch heo đã được pha loãng pH, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tinh trùng sống/chết, tinh trùng kỳ hình.
3.2.1 pH
Trong điều kiện sản xuất, dùng giấy đo pH (1 - 14) là nhanh và tiện lợi, nhưng cần bảo quản giấy đo pH ở nơi khô ráo.
28
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, nhỏ 1 - 2 giọt tinh lên giấy chỉ thị màu và đọc kết quả theo bảng so màu trong vòng 4 - 5giây.
3.2.2 Hoạt lực tinh trùng (A)
Phương pháp tiến hành như sau:
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, dùng ống hút hút một giọt tinh để lên lame, dùng lamelle đậy lên giọt tinh sao cho giọt tinh được dàn mỏng, đều. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính X - 10 và X – 40, sau đó ước lượng tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng trong vi trường kính hiển vi, và đánh giá theo thang điểm.
Bảng 2.2: Thang điểm đánh giá hoạt lực tinh trùng (Nguyễn Thiện và ctv, 2006) Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Tỉ lệ TT tiến thẳng 95- 100 85- 95 75- 85 65- 75 55- 65 45- 55 35- 45 25- 35 15- 25 05- 15 Chú thích: TT: tinh trùng 3.2.3 Nồng độ tinh trùng (C)
Ðể xác định nồng độ tinh trùng trong một liều gieo, ta sử dụng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Neubauer.
Phương pháp tiến hành như sau:
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, pha loãng 200 lần tinh dịch bằng dung dịch NaCl 3%, bằng cách dùng ống hút hồng cầu.
Hút tinh đến vạch 0,5, hút tiếp dung dịch NaCl 3% đến vạch 101. Lúc này tinh dịch đã được pha loãng 200 lần. Sau đó dùng bông hoặc giấy thấm lau khô đầu của ống hút. Lắc nhẹ rồi để yên 3 - 5 phút. Bỏ vài giọt đầu tiên trong ống rồi nhỏ tinh dịch lên mép của buồng đếm, hiện tượng mao dẫn sẽ kéo tinh dịch vào trong buồng đếm, để yên cho tinh trùng lắng xuống trong vài phút. Đặt buồng đếm lên khay kính hiển vi, quan sát với vật kính X - 10, khi thấy rõ chuyển sang vật kính X - 40 và tiến hành đếm.
29
Buồng đếm, dụng cụ pha loãng phải khô sạch, khi nạp tinh vào buồng đếm không có bọt khí lọt vào.
Cách đếm trong buồng đếm Neubauer:
Ở vật kính X - 10, quan sát toàn thể buồng đếm gồm có 9 ô vuông lớn, trong đó ô vuông lớn ở trung tâm được chia ra 25 ô vuông trung bình. Mỗi ô vuông trung bình được chia ra 16 ô vuông nhỏ. Tinh trùng được đếm ở 5 ô vuông trung bình (4 ô vuông ở 4 gốc và 1 ô vuông trung bình ở chính giữa). Khi đếm ta đếm tinh trùng từng ô ở 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ có 4 cạnh thì chỉ đếm những tinh trùng có ở trong ô đếm và những tinh trùng có ở cạnh trên và cạnh trái của ô. Đối với ô trung bình có 3 đường gạch ngang, đầu tinh trùng vào hơn ½ thì tính tinh trùng vào ô đó.
Đếm cả hai buồng đếm rồi lấy số trung bình, nếu kết quả ở hai bên chênh lệch nhau đến 30% thì phải làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành từng đám, không đếm được ở trong buồng đếm thì cũng phải làm lại.
(a) (b)
Hình 3.1: Vi trường buồng đếm Neubauer
Chú thích:
(a) 9 ô vuông lớn.
(b) 25 ô vuông trung bình chứa 16 ô vuông nhỏ/1 ô vuông trung bình. 1, 2, 3, 4, 5: các ô vuông cần đếm.
Công thức tính:
Nồng độ tinh trùng trong 1mm3:
C/mm3 = số TT 5 ô TB x 5 x 10 x 200 = số TT 5 ô TB x 104 Nồng độ tinh trùng trong 1ml:
30
C/ml = số TT 5 ô TB x 104 x103 = số TT 5 ô TB x 107 Nồng độ tinh trùng trong một liều gieo 80 ml:
C/80 ml = số TT 5 ô TB x 107 x 80 Trong đó: C: nồng độ tinh trùng TT: tinh trùng TB: trung bình 3.2.4 Tinh trùng sống/chết
Để xác định tỉ lệ tinh trùng sống, ta dùng phương pháp nhuộm Eosin 3%, trên cơ sở những tinh trùng chết sẽ bắt màu thuốc nhuộm còn những tinh trùng sống không bắt màu.
Cách tiến hành như sau: giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Lấy một lame khô sạch và ấm, sau đó nhỏ 1 giọt tinh lên lame kính, tiếp tục nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch Eosin 3% lên giọt tinh. Dùng cạnh của một lame khác phết tiêu bản, sao cho giọt tinh được dàn đều lên mặt lame. Sau đó đưa lame lên kính hiển vi kiểm tra ở vật kính X - 40. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Những tinh trùng bắt màu đỏ hoặc hồng của Eosin là tinh trùng đã chết, còn những tinh trùng màu trắng (không bị nhuộm màu) là tinh trùng sống. Đếm và ghi lại có bao nhiêu tinh trùng sống trong tổng số 300 - 500 tinh trùng đếm được một cách ngẩu nhiên và tính tỉ lệ tinh trùng sống theo công thức:
Tinh trùng sống (%) = n x100/N
Trong đó:
n: số tinh trùng sống đếm được
N: tổng số tinh trùng đếm được (300- 500).
3.2.5 Tinh trùng kỳ hình (K)
Để xác định tinh trùng kỳ hình dùng phương pháp nhuộm bằng xanh methylene 1%. Qua đó đánh giá tỉ lệ tinh trùng kỳ hình.
Cách tiến hành như sau: nhỏ 1 giọt tinh lên một đầu của lame khô, sạch, ấm, không bị trầy xước. Dùng cạnh của một lame khác dàn đều giọt tinh lên mặt lame. Sau đó, làm khô tiêu bản bằng đèn cồn. Sau khi tiêu bản đã khô, nhỏ vài giọt
31
thuốc nhuộm xanh methylene và nghiên tiêu bản cho thuốc nhuộm được dàn đều. Để yên tiêu bản trong vòng 30 phút, rồi rửa tiêu bản.
Cách rửa tiêu bản: dùng ống hút nhỏ giọt, nhỏ nhẹ nước cất xuống một đầu tiêu bản để cho nước loang nhẹ, làm trôi thuốc nhuộm. Làm khô tiêu bản dưới ngọn lửa đèn cồn rồi đưa lên kính hiển vi quan sát hình thái của tinh trùng ở vật kính X - 10 và X - 40. Đếm tổng số 300 - 500 tinh trùng xem trong đó có bao nhiêu tinh trùng kỳ hình và tính tỉ lệ tinh trùng kỳ hình theo công thức sau:
K (%) = n.100/N Trong đó: K: tỉ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình. n: tổng số tinh trùng kỳ hình đếm được. N: tổng số tinh trùng đếm được (300 - 500). Chú ý:
Đếm hết tinh trùng trong vi trường này, rồi mới chuyển sang vi trường khác.
Những vi trường quá dày khó đếm thì bỏ, chọn vi trường khác.
Chỉ dàn mỏng một lần, không chà đi xát lại gây ra kỳ hình nhân tạo dẫn đến không chính xác.