2. 3.2 Các đặc tính của tinh dịch
3.1.1Thời gian và địa điểm
Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 24 tháng 07 năm 2013 đến ngày 20 tháng 12 năm 2013. Mẫu được thu thập tại cơ sở sản xuất tinh heo Năm Sang thuộc Cầu Kè - Trà Vinh và cơ sở sản xuất tinh heo Hai Chung thuộc Chợ Gạo - Tiền Giang.
Địa điểm: tại phòng thí nghiệm E202, bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.3 Đối tượng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên tinh dịch đã được pha loãng của giống heo Pi - Du và Pi - Lan.
3.1.4 Dụng cụ - hóa chất
Thùng trữ tinh, Waterbath.
Kính hiển vi, lame, lamelle, buồng đếm Neubauer. Nhiệt kế, cốc đông, ống đông có chia vạch.
Ống hút, ống pha loãng hồng cầu. Đèn cồn, cồn 960, Pipet 1 ml và 2 ml. Giấy đo pH, nước cất, nước đá khô.
Dung dịch Nacl 3%, Blue de Methylen 1%, Rough de Eosin 3%.
3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Chúng tôi tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sau để đánh giá phẩm chất tinh dịch heo đã được pha loãng pH, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tinh trùng sống/chết, tinh trùng kỳ hình.
3.2.1 pH
Trong điều kiện sản xuất, dùng giấy đo pH (1 - 14) là nhanh và tiện lợi, nhưng cần bảo quản giấy đo pH ở nơi khô ráo.
28
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, nhỏ 1 - 2 giọt tinh lên giấy chỉ thị màu và đọc kết quả theo bảng so màu trong vòng 4 - 5giây.
3.2.2 Hoạt lực tinh trùng (A)
Phương pháp tiến hành như sau:
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, dùng ống hút hút một giọt tinh để lên lame, dùng lamelle đậy lên giọt tinh sao cho giọt tinh được dàn mỏng, đều. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính X - 10 và X – 40, sau đó ước lượng tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng trong vi trường kính hiển vi, và đánh giá theo thang điểm.
Bảng 2.2: Thang điểm đánh giá hoạt lực tinh trùng (Nguyễn Thiện và ctv, 2006) Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Tỉ lệ TT tiến thẳng 95- 100 85- 95 75- 85 65- 75 55- 65 45- 55 35- 45 25- 35 15- 25 05- 15 Chú thích: TT: tinh trùng 3.2.3 Nồng độ tinh trùng (C)
Ðể xác định nồng độ tinh trùng trong một liều gieo, ta sử dụng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Neubauer.
Phương pháp tiến hành như sau:
Giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Sau đó, pha loãng 200 lần tinh dịch bằng dung dịch NaCl 3%, bằng cách dùng ống hút hồng cầu.
Hút tinh đến vạch 0,5, hút tiếp dung dịch NaCl 3% đến vạch 101. Lúc này tinh dịch đã được pha loãng 200 lần. Sau đó dùng bông hoặc giấy thấm lau khô đầu của ống hút. Lắc nhẹ rồi để yên 3 - 5 phút. Bỏ vài giọt đầu tiên trong ống rồi nhỏ tinh dịch lên mép của buồng đếm, hiện tượng mao dẫn sẽ kéo tinh dịch vào trong buồng đếm, để yên cho tinh trùng lắng xuống trong vài phút. Đặt buồng đếm lên khay kính hiển vi, quan sát với vật kính X - 10, khi thấy rõ chuyển sang vật kính X - 40 và tiến hành đếm.
29
Buồng đếm, dụng cụ pha loãng phải khô sạch, khi nạp tinh vào buồng đếm không có bọt khí lọt vào.
Cách đếm trong buồng đếm Neubauer:
Ở vật kính X - 10, quan sát toàn thể buồng đếm gồm có 9 ô vuông lớn, trong đó ô vuông lớn ở trung tâm được chia ra 25 ô vuông trung bình. Mỗi ô vuông trung bình được chia ra 16 ô vuông nhỏ. Tinh trùng được đếm ở 5 ô vuông trung bình (4 ô vuông ở 4 gốc và 1 ô vuông trung bình ở chính giữa). Khi đếm ta đếm tinh trùng từng ô ở 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ có 4 cạnh thì chỉ đếm những tinh trùng có ở trong ô đếm và những tinh trùng có ở cạnh trên và cạnh trái của ô. Đối với ô trung bình có 3 đường gạch ngang, đầu tinh trùng vào hơn ½ thì tính tinh trùng vào ô đó.
Đếm cả hai buồng đếm rồi lấy số trung bình, nếu kết quả ở hai bên chênh lệch nhau đến 30% thì phải làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành từng đám, không đếm được ở trong buồng đếm thì cũng phải làm lại.
(a) (b)
Hình 3.1: Vi trường buồng đếm Neubauer
Chú thích: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(a) 9 ô vuông lớn.
(b) 25 ô vuông trung bình chứa 16 ô vuông nhỏ/1 ô vuông trung bình. 1, 2, 3, 4, 5: các ô vuông cần đếm.
Công thức tính:
Nồng độ tinh trùng trong 1mm3:
C/mm3 = số TT 5 ô TB x 5 x 10 x 200 = số TT 5 ô TB x 104 Nồng độ tinh trùng trong 1ml:
30
C/ml = số TT 5 ô TB x 104 x103 = số TT 5 ô TB x 107 Nồng độ tinh trùng trong một liều gieo 80 ml:
C/80 ml = số TT 5 ô TB x 107 x 80 Trong đó: C: nồng độ tinh trùng TT: tinh trùng TB: trung bình 3.2.4 Tinh trùng sống/chết
Để xác định tỉ lệ tinh trùng sống, ta dùng phương pháp nhuộm Eosin 3%, trên cơ sở những tinh trùng chết sẽ bắt màu thuốc nhuộm còn những tinh trùng sống không bắt màu.
Cách tiến hành như sau: giữ tinh dịch ở nhiệt độ cần kiểm tra khoảng 3 phút. Lấy một lame khô sạch và ấm, sau đó nhỏ 1 giọt tinh lên lame kính, tiếp tục nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch Eosin 3% lên giọt tinh. Dùng cạnh của một lame khác phết tiêu bản, sao cho giọt tinh được dàn đều lên mặt lame. Sau đó đưa lame lên kính hiển vi kiểm tra ở vật kính X - 40.
Những tinh trùng bắt màu đỏ hoặc hồng của Eosin là tinh trùng đã chết, còn những tinh trùng màu trắng (không bị nhuộm màu) là tinh trùng sống. Đếm và ghi lại có bao nhiêu tinh trùng sống trong tổng số 300 - 500 tinh trùng đếm được một cách ngẩu nhiên và tính tỉ lệ tinh trùng sống theo công thức:
Tinh trùng sống (%) = n x100/N
Trong đó:
n: số tinh trùng sống đếm được
N: tổng số tinh trùng đếm được (300- 500).
3.2.5 Tinh trùng kỳ hình (K)
Để xác định tinh trùng kỳ hình dùng phương pháp nhuộm bằng xanh methylene 1%. Qua đó đánh giá tỉ lệ tinh trùng kỳ hình.
Cách tiến hành như sau: nhỏ 1 giọt tinh lên một đầu của lame khô, sạch, ấm, không bị trầy xước. Dùng cạnh của một lame khác dàn đều giọt tinh lên mặt lame. Sau đó, làm khô tiêu bản bằng đèn cồn. Sau khi tiêu bản đã khô, nhỏ vài giọt
31
thuốc nhuộm xanh methylene và nghiên tiêu bản cho thuốc nhuộm được dàn đều. Để yên tiêu bản trong vòng 30 phút, rồi rửa tiêu bản.
Cách rửa tiêu bản: dùng ống hút nhỏ giọt, nhỏ nhẹ nước cất xuống một đầu tiêu bản để cho nước loang nhẹ, làm trôi thuốc nhuộm. Làm khô tiêu bản dưới ngọn lửa đèn cồn rồi đưa lên kính hiển vi quan sát hình thái của tinh trùng ở vật kính X - 10 và X - 40. Đếm tổng số 300 - 500 tinh trùng xem trong đó có bao nhiêu tinh trùng kỳ hình và tính tỉ lệ tinh trùng kỳ hình theo công thức sau:
K (%) = n.100/N Trong đó: K: tỉ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình. n: tổng số tinh trùng kỳ hình đếm được. N: tổng số tinh trùng đếm được (300 - 500). Chú ý:
Đếm hết tinh trùng trong vi trường này, rồi mới chuyển sang vi trường khác.
Những vi trường quá dày khó đếm thì bỏ, chọn vi trường khác.
Chỉ dàn mỏng một lần, không chà đi xát lại gây ra kỳ hình nhân tạo dẫn đến không chính xác.
3.3 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được thu thập từ quá trình khảo sát thực tế.
Dữ liệu được thu thập và xử lý dựa trên phép phân tích Anova one way sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16.0
32
Chương 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG TINH DỊCH ĐÃ ĐƯỢC
PHA LOÃNG CỦA HEO ĐỰC PI – DU Ở NHIỆT ĐỘ 36,50C, 370C VÀ 37,50C
Để đánh giá chất lượng tinh trùng một cách chính xác, không ảnh hưởng đến kết quả thực thì tốt nhất nên kiểm tra tinh dịch trong điều kiện nhiệt độ là 370C (lame, lamelle, kính hiển vi phải giữ ấm). Tuy nhiên, câu hỏi đặt ra ở đây là nếu nhiệt độ kiểm tra biến động lên hoặc xuống do điều kiện thời tiết, nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra hay không. Chính vì vậy, thí nghiệm được bố trí kiểm tra chất lượng tinh dịch ở 3 nhiệt độ 36,50C, 370C và 37,50C nhằm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ trong quá trình kiểm tra đến chất lượng tinh dịch. Chất lượng tinh dịch heo khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng kết quả sau:
Bảng 4.1: Chất lượng tinh dịch heo khi kiểm tra ở nhiệt độ 36,50C, 370C và 37,50C
Chú thích:
n: số mẫu kiểm tra
Kết quả từ Bảng 4.1 cho thấy không có sự khác biệt về hoạt lực tinh trùng khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ 36,50C, 370C và 37,50C, hoạt lực tinh trùng lần lượt là (69,503,99), (75,703,18) và (75,902,75) với (P=0,322). Theo TCVN 1859/76 yêu cầu về hoạt lực tinh trùng heo trước khi phối giống tối thiểu là 70%. Kết quả thí nghiệm cho thấy, hoạt lực tinh trùng khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ 36,50C, 370C và 37,50C của thí nghiệm đều đạt yêu cầu theo TCVN 1859/76. Như vậy, nếu nhiệt
Chỉ tiêu Đơn vị tính
Nhiệt độ kiểm tra
36,50C 370C 37,50C (n=10) pH - 6,900,03 7,100,03 7,100,03 Hoạt lực (A) % 69,503,99 75,703,18 75,902,75 Nồng độ (C) 109/80ml 4,080,19 4,000,21 4,080,14 Tỉ lệ sống % 77,202,43 86,101,03 80,202,24
33
độ kiểm tra chất lượng tinh dịch dao động trong khoảng 0,5% không ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra. Ngoài ra, những mẫu tinh đã kiểm tra có hoạt lực tinh trùng cao hơn tiêu chuẩn, nên có thể kết luận rằng bước đầu những lọ tinh này đủ điều kiện để tiến hành gieo cho gia súc cái. Theo Nguyễn Thiện và ctv (2006), nhiệt độ môi trường ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng theo 2 hướng: tăng cường hoặc làm giảm sức sống tinh trùng, do đó kéo dài hoặc rút ngắn đời sống của tinh trùng. Điều này cho thấy, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt lực tinh trùng.
Theo TCVN 1859/76, chất lượng tinh dịch là đạt chuẩn khi có tỉ lệ tinh trùng sống tối thiểu là 70%, kết quả kiểm tra của thí nghiệm ở 3 nhiệt độ khác nhau 36,50C, 370C và 37,50C lần lượt là (77,202,43), (86,101,03) và (80,202,24), cao hơn nhiều so với tiêu chuẩn quy định. Tuy nhiên, tỉ lệ tinh trùng sống khi kiểm tra ở nhiệt độ 370C là cao nhất so với nhiệt độ 36,50C và 37,50C.
Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt về nồng độ tinh trùng khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ khác nhau. Nồng độ tinh trùng khi kiểm tra ở nhiệt độ 36,50C là (4,080,19), 370C là (4,000,21) và 37,50C là (4,080,14), với (P=0,937). Theo Trần Tiến Dũng (2002) lượng tinh trùng trong một liều gieo cho heo nái ngoại là 2 - 3 tỉ/ml. Kết quả thí nghiệm khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ 36,50C, 370C và 37,50C đều cao hơn nhiều so với nghiên cứu. Nồng độ tinh trùng trong một liều phối sao cho vừa phải chứa đựng đủ số lượng tinh trùng cần thiết để có thể thụ thai tốt cho con cái, vừa phải có tác dụng kích thích nhu động tử cung con cái, nồng độ tinh trùng càng cao thì tỉ lệ đậu thai sẽ càng tăng. Như vậy, nồng độ tinh trùng của giống heo Pi - Du tại cơ sở sản xuất tinh Năm Sang - Trà Vinh là đủ tiêu chuẩn để gieo tinh cho gia súc cái.
Kết quả thí nghiệm cho thấy pH khi kiểm tra ở 3 nhiệt độ khác nhau dao động từ 6,9 - 7,1. Kết quả này phù hợp với tiêu chuẩn Việt Nam 1859/76 pH tinh dịch đạt chuẩn từ 6,8 - 8,1.
Nhìn chung, các chỉ tiêu chất lượng tinh dịch đã được pha loãng của heo đực Pi - Du tại cơ sở Năm Sang - Trà Vinh đều đạt tiêu chuẩn quy định của nhà nước TCVN 1859/76. Như vậy, chúng ta có thể sử dụng nhiệt độ dao động từ 36,5 - 37,50C để kiểm tra các chỉ tiêu. Tuy nhiên, kiểm tra chất lượng tinh dịch ở nhiệt độ 370C là cho kết quả tốt nhất.
34
4.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG TINH DỊCH ĐÃ ĐƯỢC
PHA LOÃNG VÀ BẢO QUẢN CỦA HEO ĐỰC PI – LAN Ở NHIỆT ĐỘ
200C, 300C VÀ 370C
Trước khi dẫn tinh cho gia súc cái, các cơ sở sản xuất tinh heo nhân tạo cần phải vận chuyển tinh dịch đi xa hoặc tỉ lệ sử dụng tinh dịch thấp, nên các cơ sở này cần phải giữ tinh dịch vài ngày mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Chính vì vậy, thí nghiệm được bố trí bảo quản tinh dịch ở 3 nhiệt độ khác nhau 200C, 300C và 370C, nhằm tìm ra một nhiệt độ thích hợp để vừa kéo dài thời gian sống của tinh trùng, vừa không làm ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh. Chất lượng tinh dịch khi bảo quản ở 3 nhiệt độ khác nhau được trình bày ở bảng kết quả sau:
Bảng 4.2: Chất lượng tinh dịchđược bảo quảnở nhiệt độ 200C, 300C và 370C
Chú thích:
n: số mẫu kiểm tra
Kết quả từ Bảng 4.4 cho thấy, có sự khác biệt về hoạt lực tinh trùng khi bảo quản tinh dịch ở 3 nhiệt độ khác nhau. Hoạt lực tinh trùng của thí nghiệm khi bảo quản ở nhiệt độ 200C là (50,003,33), ở 300C là (55,001,67), ở 370C là (65,001,67), với (p=0,000). Theo Lê Hoàng Sĩ (2000), nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hoạt động tinh trùng. Khi nhiệt độ thấp tinh trùng giảm hoạt động và rơi vào trạng thái tiềm sinh. Khi nhiệt độ cao tinh trùng hoạt động càng nhanh, tiêu hao năng lượng và chết rất nhanh. Như vậy, chúng ta có thể kết luận rằng nhiệt độ bảo quản tinh dịch ở 200C cho kết quả tốt hơn khi bảo quản tinh dịch ở 300C và 370C, vì khi chúng ta bảo quản tinh dịch nhiệt độ 200C tinh trùng ít hoạt động và ít tiêu hao năng lượng, nên tỉ lệ sống cao hơn, tinh trùng sống được thời gian dài.
Chỉ tiêu Đơn vị tính Nhiệt độ bảo quản 200C 300C 370C (n=9) (n=9) (n=9) Hoạt lực (A) % 50,003,33 55,001,67 65,001,67 Nồng độ (C) 109/80ml 2,001,33 2,400,27 2,001,33 Tỉ lệ sống % 94,500,17 93,500,17 91,500,17
35
Theo TCVN 1859/76, chất lượng tinh dịch là đạt tiêu chuẩn khi có tỉ lệ tinh trùng sống tối thiểu là 70%. Tỉ lệ tinh trùng sống của thí nghiệm khi bảo quản tinh dịch ở 3 nhiệt độ khác nhau 200C, 300C và 370C lần lượt là: (94,500,17), (93,500,17) và (91,500,17) với (P=0,000), kết quả thí nghiệm cao hơn rất nhiều và phù hợp với TCVN 1859/76. Tỉ lệ tinh trùng sống khi bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ 200C cho kết quả cao hơn khi bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ 300C và 370C. Điều này có thể giải thích là do, khi chúng ta bảo quản tinh dịch ở 200C, nhiệt độ này ức chế một phần nào sự hoạt động của tinh trùng, nên tinh trùng ít hoạt động và tỉ lệ tinh trùng sống sẽ caohơn.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ tinh trùng khi bảo quản ở nhiệt độ 200C và 370C là (2,001,33), ở nhiệt độ 300C là (2,400,27), với (P=0,000). Khi so với nghiên cứu của Đào Đức Thà (2006), nồng độ tinh trùng trong 1 liều gieo đối với heo nái ngoại là 1,5 - 2x109 tinh trùng, kết quả thí nghiệm ở 3 nhiệt độ bảo quản đều đạt tiêu chuẩn. Theo Nguyễn Thiện và ctv (2006), nồng độ tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: giống, tuổi, khí hậu, chế độ nuôi dưỡng, sử dụng. Điều này cho thấy, yếu tố nhiệt độ không ảnh hưởng đến nồng độ tinh trùng, nên khi chúng ta bảo quản tinh dịch ở bất cứ nhiệt độ nào thì cũng không làm thay đổi nồng độ tinh trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy, chúng ta có thể kết luận rằng khi bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ 200C thì chất lượng tinh dịch tốt hơn khi bảo quảnở nhiệt độ 300C và 370C.
36
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua thời gian thực hiện đề tài ‘‘Ảnh hưởng của nhiệt độ kiểm tra và nhiệt độ bảo quản lên chất lượng tinh dịch heo trên thị trường tại Trà Vinh và