4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.Dấu hiệu bệnh lý bệnh xuất huyết do liên cầu khuẩn Streptococcus
Kết quả ựo các yếu tố môi trường trong thời gian thu mẫu ở các ao nuôi xuất hiện bệnh: ựộ mặn dao ựộng từ 15 Ờ 19,5Ẹ, pH dao ựộng từ 7,7 Ờ 8,5, nhiệt ựộ dao ựộng từ 18 Ờ 270 C. Các thông số môi trường trên là thắch hợp cho sự tồn tại và phát triển của cá rô phi vằn giống lớn nuôi ở nước lợ.
Dấu hiệu bệnh lý:
Kết quả quan sát mẫu cá bệnh thu ựược trong quá trình thu mẫu có một hoặc nhiều dấu hiệu như: Cá yếu, bỏ ăn, bơi lờ ựờ tầng mặt, một số bơi không ựịnh hướng, bơi xoay tròn, mắt lồi, xuất huyết ở gốc vây, hậu môn xuất huyết hoặc sưng, trướng bụng, phân thải ra có lõi trắng nhầy không tan trong nước và dải phân rất dài một số có hiện tượng ựen mình hoặc phần ựầu. Giải phẫu nội tạng thấy ruột không có thức ăn, mật sưng to, xoang bụng tắch dịch, gan có hoặc không có hiện tượng xuất huyết (hình 6). Kết quả dấu hiệu bệnh lý này có sự tương ựồng với báo cáo của các tác giả Nguyễn Viết Khuê & ctv, 2009, Eldar &ctv, 1994 và của Rogeniosalvado & ctv, 2005 về dấu hiệu bệnh lý của bệnh xuất huyết do vi khuẩn Streptococcus. Kitao (1993) và Plumb (1994) cung cấp một số dấu hiệu phân biệt ựối với bệnh do liên cầu khuẩn
Streptococcus. Chúng bao gồm bơi thất thường, cá tối màu, xuất huyết ở gốc vây và nắp mang, ựôi mắt mờ ựục hoặc có hiện tượng Ổpop-eyeỖ, bụng sưng lên. Cả Kitao (1993) và Plumb (1994) cho thấy mắt của cá bị ảnh hưởng [5, 27, 31].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 28
Hình 6. Cá bị chết, nắp mang, gốc vây xuất huyết, mắt lồi, mật sưng to, gan xuất huyết, xoang bụng tắch dịch. Ảnh nhìn từ trái qua phải và
trên xuống dưới. 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Kết quả kiểm tra tác nhân gây bệnh: 100% các mẫu thu không nhiễm ký sinh trùng và nấm gây bệnh. Khi sử dụng phương pháp nhuộm Gram mẫu phết tươi các tiêu bản smear các cơ quan ựắch gan, thận, não, máu thì tôi ựều phát hiện rất thuần một loại cầu khuẩn bắt màu gram dương (màu xanh tắm). Các vi khuẩn này xuất hiện với mật ựộ và ựộ thuần cao trên các tiêu bản phết mô (hình 7). Các vi khuẩn này cho kết quả âm tắnh với phản ứng Catalase. điều này khẳng ựịnh chúng thuộc giống vi khuẩn Streptococcus spp
Hình 7. Vi khuẩn dạng cầu, bắt màu Gram(+) có trong tiêu bản phết tươi mô gan,thận sau khi nhuộm Gram soi ở vật kắnh 100X.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 29
Kiểm tra 150 con cá có biểu hiện bệnh thu ựược kết quả thể hiện ở bảng sau:
Bảng 5. Kết quả phân lập vi khuẩn
Kết quả phân lập vi khuẩn đợt thu mẫu Số mẫu thu (con) Streptococcus spp Tỷ lệ (%) Vi khuẩn gây bệnh khác Tỷ lệ (%) 1 15 7/15 46,67 0 0 2 15 3/15 20,00 0 0 3 15 13/15 86,67 0 0 4 15 15/15 100 0 0 5 15 3/15 20,00 0 0 6 15 4/15 26,67 0 0 7 15 12/15 80,00 0 0 8 15 5/15 33,33 0 0 9 15 3/15 20,00 0 0 10 15 3/15 20,00 0 0 Tổng 150 68 45.33 0 0
Qua bảng kết quả cho thấy, trong 150 mẫu thu có dấu hiệu bệnh thì có 68 mẫu phân lập ựược vi khuẩn với tỷ lệ 45,33%. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Viết Khuê & ctv (2009)[4]. Sau khi thử phản ứng sinh hóa, kết quả cho thấy rằng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập ựược thuộc giống Streptococcus và từ ựó chúng tôi ựã ựịnh danh ựược tên loài vi khuẩn theo bảng 6.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 30
Bảng 6. Kết quả phản ứng sinh hóa của VK ựã phân lập của cá rô phi trên kắt API 20 Strep và một số phản ứng phụ.
Các loài vi khuẩn ựã phân lập Kết quả
Chỉ tiêu Streptococcus sp1 Streptococcus sp2 Streptococcus sp3
Màu KL/NA Trắng Trắng Vàng Nhuộm Gram + + + Hình dạng VK CK CK CK Khả năng dung huyết trên mt BA - + V OF -/+ -/+ -/+ Catalase - - - Mọc trên mt 6,5% - - - Mọc trên mt1-3% + + + Mọc trên mt 0% + + + Mọc trên mt 370 C + + + Mọc trên mt 100C + + - Mọc trên mt 290C + + + VP + - - HIP + - - ESC - + + PYRA - + + α-Gal - - - β- Gur - + -
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 31 β- Gal - - - PAL + + - LAP + + + ADH + + - RIB + + + L- Ara - - - Manitol - + - Sorbitol - - - Lactose - - - Trehalose - + + Inuline - - - D-raf - - - AMD - - + Glycogene - + +
Ghi chú: +: dương tắnh CK : Cầu khuẩn mt: môi trường -: âm tắnh V : Variable
Dựa vào kết quả thử kắt API 20 Strep và một số phản ứng kèm theo ở bảng 6 ta thấy 3 chủng vi khuẩn Streptococcus sp1, Streptococcus sp2, Streptococcus sp3 ựều là vi khuẩn gram dương, dạng cầu khuẩn, có phản ứng catalase âm tắnh, có phản ứng lên men trên môi trường OF, ựều mọc ở ựộ mặn 0 Ờ 3 %, ựều mọc ở 370 C và 290 C. đều có phản ứng lên men ựường ribose, phản ứng dương Leucine arylamidase và các phản ứng âm tắnh : raffinose (RAF), Sorbitol (SOR), Lactose (LAC), Inuline (INU), Anpha GAL (anpha galactosidae), ư GAL(bêta galactosidae).
Chủng Streptococcus sp1 và Streptococcus sp2 khác nhau ở các phản ứng : Voges- Proskauer (VP), hippurate (HIP), Esculine (ESC), Pyruvate
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 32
(PYRA), bêta glucoromidase (β- Gur), Manitol, trehalose (TRE), glycogene (GLYG). Chủng Streptococcus sp1 dương tắnh với các phản ứng PV, HIP. Chủng Streptococcus sp2 dương tắnh với các phản ứng ESC, PYRA, β- Gur, Manitol, TRE, GLYG. đặc biệt giữa 2 chủng này có sự khác biệt khi nuôi cấy trên môi trường BA. Chủng Streptococcus sp2 tạo dung huyết trên môi trường thạch máu BA còn chủng Streptococcus sp1 không dung huyết trên môi trường thạch máu.
Hai chủng Streptococcus sp2 và Streptococcus sp3 có các phản ứng khác nhau : ư - glucoromidase (ư GUR), alkaline phosphatese (PAL), arginine hidrolase (ADH), Manitol, amygdalin (AMD). Chủng Streptococcus sp3 có một phản ứng dương AMD, chủng S.iniae có các phản ứng còn lại là dương tắnh. Chủng Streptococcus sp2 mọc ở 100C còn chủng Streptococcus sp3 không mọc ở 100C. Chủng Streptococcus sp2 có khuẩn lạc màu trắng còn
Streptococcus sp3 có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường NA sau 24 -48 h ủ trong tủ ấm 290 C.
Chủng Streptococcus sp1 và Streptococcus sp3 có các phản ứng khác nhau : Voges- Proskauer (VP), hippurate (HIP), Esculine (ESC), Pyruvate (PYRA), arginine hidrolase (ADH), trehalose (TRE), amygdalin (AMD), glycogene (GLYG). Chủng Streptococcus sp3 dương tắnh với 3 phản ứng PV, HIP và DAP, chủng Streptococcus sp1 có các phản ứng dương tắnh PYRA, TRE, AMD, GLYG. Streptococcus sp1 mọc ở 100C còn chủng Streptococcus
sp3 không mọc ở nhiệt ựộ ựó. Streptococcus sp1 có khuẩn lạc màu trắng còn
Streptococcus sp3 có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường NA sau 24 -48 h ủ trong tủ ấm 290 C.
Xác ựịnh vi khuẩn Streptococcus sp1 : Dựa vào kết quả bảng 6 ta thấy chủng Streptococcus sp1 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, kắch thước nhỏ khoảng 1mm (hình 8). Nhuộm gram soi trên kắnh hiển vi bằng vật kắnh dầu (x100)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 33
thấy vi khuẩn hình cầu hoặc hình trứng, tồn tại ựơn hoặc chuỗi. Chuỗi có thể ngắn hoặc dài. Vi khuẩn bắt màu xanh tắm của thuốc nhuộm (hình 9). Chủng vi khuẩn ựã phân lập không dung huyết trên môi trường thạch máu, không có khả năng di ựộng, mọc ở 10 0 C Ờ 370 C, phát triển ở ựộ muối 0-3%, không phát triển ở ựộ mặn 6,5% có phản ứng lên mên trên môi trường OF. Kết quả thử phản ứng sinh hóa trên kắt thử API 20 Strep cho thấy: Vi khuẩn có các phản ứng dương tắnh như Voges- Proskauer (VP), hippurate (HIP), alkaline phosphatese (PAL), LAP (Leucine arylamidase), ADH (arginine hidrolase), ribose (RIB) và trehalose (TRE). Các phản ứng còn lại như Esculine (ESC), Pyruvate (PYRA), Anpha GAL (anpha galactosidae), ư GUR (bêta glucoromidase), ư GAL(bêta galactosidae), Arabinose (ARA), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), Lactose (LAC), Inuline (INU), raffinose (RAF), amygdalin (AMD) và glycogene (GLYG) cho kết quả âm tắnh (hình 10). Tra theo bảng phân loại của Nicky B. Buller (2004) thấy các phản ứng của chủng ựã phân lập
Streptococcus sp1 có sự tương ựồng cao với chủng vi khuẩn S. agalactiae. Vậy chủng vi khuẩn ựã phân lập Streptococcus sp1 là S. agalactiae. đã có nhiều nghiên cứu, báo cáo về vi khuẩn S. agalactiae gây bệnh trên cá rô phi : tác giả B. Austin và D. A. Austin,1987 ; Nicky B. Buller (2004) ; Eldar & ctv 1994 ; đồng Thanh Hà & ctv 2010[6, 17, 27, 29]. điều này giúp chúng tôi khẳng ựịnh rằng vi khuẩn ựã phân lập là vi khuẩn S. agalactiae.
Hình 8. Khuẩn lạc của trên môi trường NA và S.agalactiae không dung huyết trên môi trường BA.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 34
Hình 9. Hình dạng vi khuẩn S. agalactiae khi nhuộm gram
Hình 10. Kết quả trên kit API 20 Strep của S. agalactiae và phản ứng OF Xác ựịnh vi khuẩn Streptococcus sp2:
Qua kết quả bảng 6 ta thấy chủng vi khuẩn ựã phân lập Streptococcus sp2 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, bề mặt nhẵn, không sinh sắc tố, kắch thước nhỏ khoảng 1 - 2mm (hình 11). Nhuộm gram vi khuẩn bắt màu xanh tắm, có dạng hình cầu hoặc hình trứng, tồn tại dạng ựơn hoặc tạo chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài (hình 12). Chủng vi khuẩn ựã phân lập dung huyết trên môi trường thạch máu, có khả năng di ựộng, mọc ở 100 C Ờ 370 C, phát triển ở ựộ muối 0-3%, không phát triển ở ựộ mặn 6,5% có phản ứng lên men trên môi trường OF. Kết quả thử phản ứng sinh hóa trên kắt thử API 20 Strep cho thấy: Vi khuẩn có các phản ứng dương tắnh như: Esculine (ESC), Pyruvate (PYRA), (Leucine arylamidase)LAP, trehalose (TRE), amygdalin (AMD), glycogene (GLYG), ribose (RIB). Các phản ứng âm tắnh gồm: Voges- Proskauer (VP), hippurate (HIP), (anpha galactosidae) GAL, (bêta glucoromidase) ư GUR, (bêta galactosidae) ư GAL, PAL (alkaline phosphatese), (arginine hidrolase)ADH, Arabinose (ARA), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), Lactose (LAC), Inuline
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 35
(INU), raffinose (RAF), glycogene (GLYG) (hình 13). Tra theo bảng phân loại của N.B Buller (2004) có thể xác ựịnh vi khuẩn Streptococcus sp2 là
S.iniae. Tác giả Eldar & ctv(1994) cũng ựã phân lập ra vi khuẩn S.iniae gây
bệnh trên cá rô phi. N.B Buller (2004) và Austin và D. A. Austin,1987 cũng khẳng ựịnh S.iniae là vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi [17,27,29].
Hình 11. Hình ảnh khuẩn lạc và sự dung huyết của S. iniae
Hình 12. Hình dạng vi khuẩn S.iniae khi nhuộm gram
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 36
Xác ựịnh vi khuẩn Streptococcus sp3: Tương tự như trên dựa vào kết quả bảng 6 ta thấy chủng vi khuẩn ựã phân lập Streptococcus sp3 có ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc màu vàng, bề mặt trơn nhẵn, hơi lồi, kắch thước nhỏ khoảng 1 - 2mm (hình 14). Nhuộm gram vi khuẩn bắt màu xanh tắm, soi dưới kắnh hiển vi vật kắnh dầu (x100) thấy các tế bào vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc hình trứng, tồn tại dạng ựơn hoặc tạo chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài (hình 15). Chủng vi khuẩn ựã phân lập không mọc ở 100 C và không mọc ở ựộ mặn 0%. Có phản ứng catalase âm tắnh. Có phản ứng lên men trên môi trường OF. Kết quả thử test Api 20 Strep (hình 16) ta thấy vi khuẩn có các phản ứng dương tắnh: ESC, PYRA, LAP, RIB, TRE, STRA, GLYC và âm tắnh với các phản ứng : PV, HIP, α- GAL, ư GUR, ư GAL, PAL, ADH, L- ARA, MAN, SOR, LAC, INU, RAF. So sánh với bảng kết quả phân loại của N.B Buller (2004) và Austin và D. A. Austin,1987 chúng tôi thấy chủng vi khuẩn này có kết quả phản ứng tương ựồng không cao với các chủng S.iniae hoặc S. agalactiae . Vậy chủng vi khuẩn Streptococcus phân lập từ cá rô phi chưa xác ựịnh ựược chắnh xác tên loài. Chúng tôi tạm ựể tên chủng vi khuẩn này là
Streptococcus sp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 37
Hình 15. Hình dạng vi khuẩn Streptococcus sp
Hình 16. Kết quả thử test API 20 Strep ựịnh danh Streptococcus sp, phản ứng OF
Cá rô phi giống lớn nuôi nước lợ có dấu hiệu bị bệnh xuất huyết hoặc bệnh Ổcá ựiênỖ ựã phân lập ựược 3 chủng vi khuẩn : S.agalactiae, S.iniae và
Streptococcus sp. Các chủng cầu khuẩn Streptococcus gây bệnh ở cá chủ yếu là ba loại vi khuẩn: S.iniae, S.difficile, S.agalactiae. Vi khuẩn phân lập từ não và các cơ quan khác của cá rô phi bị ảnh hưởng từ Thái Lan và Indonesia ựã ựược xác ựịnh là S. agalactiae và S.iniae [33].
Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh do vi khuẩn S.iniae và
S.agalactiae là rất phổ biến và ảnh hưởng ựến cá rô phi nuôi tại khu vực đông Nan Á [34].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 38
Bảng 7. Thành phần loài vi khuẩn trên cá rô phi giống lớn bị bệnh xuất huyết do liên cầu khuẩn Streptococcus
TT Loài vi khuẩn Tần số nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%)
1 S.iniae 15/68 22,06
2 S.agalactiae 54/68 79,41
3 Streptococcus sp 3/68 1,47
Vi khuẩn S. agalactiae thu ựược trên tổng số mẫu cá bị bệnh (54/68 mẫu) cao nhất sau ựó ựến vi khuẩn S.iniae (15/68 mẫu), còn vi khuẩn
Streptococcus sp thu ựược là thấp nhất (3/68 mẫu). Vi khuẩn gây bệnh làm chết cá trong quá trình thu mẫu là do hiện tượng bội nhiễm. Năm 2009 tại một số hồ chứa của Malaysia ựã ghi nhận ựược hiện tượng cá rô phi nuôi lồng bị chết, kết quả thu mẫu ựã phân lập ựược vi khuẩn từ các cơ quan. đặc biệt là mẫu thu ở mắt, não, thận. Trong ựó vi khuẩn S. agalactiae chiếm 70% tổng số loài vi khuẩn Streptococcus ựược xác ựịnh, 30% còn lại là Leuconostoc spp
và S. constellatus[22]. Streptococcus agalactiae (bao gồm cả mô tả trước ựây
S. difficilis / difficile, phân loại lại là S. agalactiae) là nguyên nhân chắnh của Streptoccosis cá rô phi nuôi. S. iniae cũng gây ra tử vong nhưng ựến một mức ựộ ắt hơn. Không có sự khác biệt rõ ràng trong các dấu hiệu lâm sàng gây ra bởi một hay khác của các loài Streptococcus[30].
Tóm lại: Tôi ựã tiến hành thu mẫu và phân lập ựược 3 loài vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) giống lớn nuôi nước lợ ở Quý Kim, Hải Phòng là: S.agalactiae, S.iniae và
Streptococcus sp.
Ba loài vi khuẩn ựã phân lập S.agalactiae, S.iniae và Streptococcus sp ựều mọc ở 370C, và phát triển ở ựộ muối 1 Ờ 3% ựiều ựó cho thấy chúng có
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 39
nguy cơ cao lây nhiễm cho người, ựộng vật trên cạn và cá. Nguy cơ này ựược khẳng ựịnh chắc chắn hơn khi có nhiều báo cáo của các tác giả Mirchell và ctv năm 1997, Yohiaki Kawamura và ctv năm 2005 về bệnh do vi khuẩn
Streptococcus gây ra trên người và ựộng vật khác [31, 32].
4.3. Kết quả cảm nhiễm nhân tạo
Tiến hành cảm nhiễm nhân tạo ựể khẳng ựịnh những loài vi khuẩn ựã phân lập ựược (S.agalactiae, S.iniae và Streptococcus sp) là tác nhân gây bệnh.
Cá ựược ựưa vào cảm nhiễm hoàn toàn khỏe mạnh, kắch thước từ 9 -12,5 cm.được nuôi thuần hóa 2 ngày trước khi tiến hành cảm nhiễm nhân tạo. Các yếu tố môi trường trong thời gian thắ nghiệm cảm nhiễm: Nhiệt ựộ 20 Ờ 24 0 C, pH: 7,8 Ờ 8,2, ựộ mặn 19Ẹ, Oxy 4mg/l, sục khắ và cho cá ăn hàng ngày. Cá gây cảm nhiễm nhân tạo ựược tiêm vào cơ lưng, liều tiêm 0,1 ml/cá thể ( LD50 : 107- 109 tb/ml). Cá ở lô ựối chứng tiêm 0,1 ml/ cá thể nước muối sinh lý 0,85%.
Sau 1 Ờ 4 ngày gây cảm nhiễm với nồng ựộ vi khuẩn tiêm vào cho cá là 2,7ừ107- 2,7ừ109 tế bào/ml cá bắt ựầu có dấu hiệu bệnh lý và cái chết ựầu tiên xuất hiện (hình 17 và bảng 8). Lô ựối chứng, cá vẫn khỏe mạnh, hoạt ựộng bình thường.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 40
Bảng 8. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi vằn của 2 lần cảm nhiễm 3 chủng vi khuẩn ựã phân lập
Vi khuẩn Nồng ựộ VK (tb/ml) Thời gian phát bệnh và chết lần ựầu tiên (ngày) Dấu hiệu bệnh lý
2,7ừ107 4 Cá yếu, bỏ ăn, bơi loạn xạ,