2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.2.4.Cảm nhiễm nhân tạo
Sau khi sơ bộ xác ựịnh vi khuẩn ựể có kết luận chắc chắn rằng chúng là tác nhân gây bệnh tiến hành thắ nghiệm cảm nhiễm nhân tạo bằng vi khuẩn ựã phân lập cho cá khỏe.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 22
Hình 3. Sơ ựồ gây nuôi cảm nhiễm các chủng vi khuẩn ựã phân lập
+ Nguyên tắc cảm nhiễm vi khuẩn
- Tiêm trực tiếp vào cơ lưng cá, liều tiêm mỗi con cá thắ nghiệm là 0,1ml hỗn dịch vi khuẩn.
- Xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn
Dùng phương pháp so màu, dùng bộ ống chuẩn MC- Falands + Theo dõi thắ nghiệm
- Liều tiêm cho mỗi cá thắ nghiệm là 0,1ml/ cá thể
- Theo dõi sự hoạt ựộng, những biến ựổi sinh lý, số cá phát bệnh, cá chết theo thời gian 6, 12, 24, 48 và ựến khi cá phát bệnh chết 50%, trong quá trình thắ nghiệm
VK thuần chủng ựã ựược phân lập từ cá bệnh
Xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn
Tiêm vào cơ lưng cá
Cá phát bệnh do cảm nhiễm
Phân lập vi khuẩn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 23
- Mỗi bể thắ nghiệm là 10 con cá khỏe mạnh, kắch cỡ ựồng ựều. Cá ựược nuôi thuần hóa 48h trước khi làm thắ nghiệm.
- Lô ựối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,85% (0,1ml/cá thể)
- Chủng vi khuẩn cảm nhiễm phải thuần chủng, ựược nuôi cấy trên môi trường NA 1,5% NaCl trước khi cảm nhiễm 24h.
- Cơ sở dùng liều vi khuẩn gây bệnh cho cá là dựa vào LD50 của loài vi khuẩn gây bệnh ựối với cá rô phi.
- Các nồng ựộ tiêm từ 107 tb/ml, 108 tb/ml, 109 tb/ml.
- Trong quá trình thắ nghiệm theo dõi các yếu tố môi trường: nhiệt ựộ, pH, ựộ mặn và oxy hòa tan.
- Khi cá phát bệnh tiến hành giải phẫu, cấy mẫu bệnh phẩm (gan, thận), phân lập và nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp ựã nêu trên.
- So sánh kết quả phân lập mẫu cá bị bệnh do cảm nhiễm với vi khuẩn ựã sử dụng cảm nhiễm bệnh.
* Bố trắ thắ nghiệm
Các lô bố trắ thắ nghiệm ựược bố trắ bốc thăm ngẫu nhiên và ựược lặp lại 02 lần. Mỗi ựợt làm cảm nhiễm lấy ra 03 bể cho chủng vi khuẩn 1, 03 bể cho chủng vi khuẩn 2, 03 bể cho chủng vi khuẩn 3, 03 bể còn lại làm lô ựối chứng. Mỗi chủng vi khuẩn bố trắ 03 nồng ựộ khác nhau, mỗi nồng ựộ ựược bố trắ 2 lần bằng 2 lần cảm nhiễm.
Hình 4. Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm cảm nhiễm cá lần 1
Bể 1 Bể 2 Bể 3 Bể 4
Bể 5
Bể 6 Bể 7 Bể 8 Bể 9
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 24 - Chủng vi khuẩn 1 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 2); 2,7ừ108 tb/ml (bể 10); 2,7ừ109 tb/ml (bể 12). - Chủng vi khuẩn 2 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 4); 2,7ừ108 tb/ml (bể 7); 2,7ừ109 tb/ml (bể 11). - Chủng vi khuẩn 3 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 1); 2,7ừ108 tb/ml (bể 6); 2,7ừ109 tb/ml (bể 8). - Các bể còn lại làm ựối chứng.
Hình 5. Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm cảm nhiễm cá lần 2
- Chủng vi khuẩn 1 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 2); 2,7ừ108 tb/ml (bể 5); 2,7ừ109 tb/ml (bể 10). - Chủng vi khuẩn 2 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 3); 2,7ừ108 tb/ml (bể 7); 2,7ừ109 tb/ml (bể 9). - Chủng vi khuẩn 3 với nồng ựộ: 2,7ừ107 tb/ml (bể 4); 2,7ừ108 tb/ml (bể 8); 2,7ừ109 tb/ml (bể 12).
- Các bể còn lại làm lô ựối chứng.