2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.2.3.Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Dựa vào phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ở cá và ựộng vật thủy sản của N.B. Buller (2004).
Hình 1. Sơ ựồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn
Mẫu cá bệnh
Thu mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy, phân lập
Hình thái khuẩn lạc
Nhuộm Gram Thử các phản ứng sinh hóa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 18
* Cấy vi khuẩn
Cấy chọn khuẩn lạc: Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục ựắch là làm cho khuẩn lạc ựứng riêng rẽ. Ta tiến hành ựốt nóng ựỏ que cấy sau mỗi vùng cấy ựể làm cho mật ựộ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn ựứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc sau thời gian nuôi cấy.
Nuôi vi khuẩn: Mẫu bệnh phẩm thu ựược nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 290 C sau 24- 48 giờ kiểm tra hình thái khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc ựể cấy tiếp lên môi trường tăng sinh. Sau 24 giờ nuôi cấy nhuộm gram, nếu ựược vi khuẩn thuần tiến hành thử các phản ứng sinh hóa theo bộ kắt API 20E hoặc API 20STREP và một số phản ứng sinh hóa truyền thống cần thiết cho việc ựịnh danh vi khuẩn.
* Nghiên cứu hình thái vi khuẩn :
Sử dụng phương pháp nhuộm Gram
- Sau khi ựược giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lên lam, cho 01 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng que cấy dàn mỏng trên lam kắnh.
- Hơ cao lam kắnh có mẫu trên ngọn lửa ựèn cồn, ựể cố ựịnh vi khuẩn. - Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tắm tinh thể) lên tiêu bản, ựể yên 30- 60 giây. - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) ựể cố ựịnh trong 1 phút (tiêu bản có màu ựen). - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) ựể nghiêng ựầu một bên lam ựể cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu.
- Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) ựể cố ựịnh 1 ựến 2 phút.
- Rửa nước, ựể khô hoặc dùng giấy thấm khô, không ựược ựể xước mẫu. - Soi dưới kắnh hiển vi bằng vật kắnh dầu (ựộ phóng ựại x1000).
Dưới kắnh hiển vi có thể xác ựịnh ựược vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tắm. Khi ựược vi khuẩn thuần tiến hành
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 19
nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng trypton, ựể có dung dịch ở dạng huyền phù thử phản ứng sinh hóa.
* Thử phản ứng sinh hóa bằng bộ kắt API 20E, API 20 STREP
- Nguyên lý
Phương pháp này dùng 21 tiêu chuẩn thử sinh hóa cho phép ựịnh tên một số loài vi khuẩn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae.
Kắt thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ trong có chứa các chất nền ựã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt ựộng của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm ựục môi trường. Sau 24h ựọc các phản ứng ựối chiếu theo bảng kết quả ựể ựịnh tên.
- Các bước phân lập vi khuẩn theo kit API 20E
NA Trypton
Hình 2. Quy trình kắt API 20E
OF-F OF-O ONPG ADH LDC OCD CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Qui trình th kắt API 20E
1 2
3 4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 20
- Chuẩn bị kit
+ Chuẩn bị hộp ủ và ựổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng) vào chỗ lõm ựể tạo hơi ẩm
Chuẩn bị ủ
+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho ựầy vào các ống. + đổ 1 lớp dầu vào các ống thử có ngạch chân ở dưới( ADH, LDC, ODC, H2S, URE) ựể tạo môi trường yếm khắ.
+ đổ ựầy dịch huyền phù vi khuẩn vào cả ống và cốc (CIT, VP, GEL) + Thử thêm ngoài trên 2 ống O/F
Ủ mẫu
+ Ủ các mẫu phản ứng ựó ở nhiệt ựộ 27- 290C thời gian 24- 48h.
đọc kết quả
đọc kết quả theo bảng ựọc và dùng các thuốc thử hiển thị kết quả: + Thử TDA: Cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu ựỏ là dương tắnh. + Thử IND: Cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng trong ống thử là dương tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 21
+ Thử VP: Cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2, ựợi ắt nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc ựỏ là dương tắnh. Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tắnh.
+ Thử NO2: Cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLU. đợi sau 2- 5 phút chuyển màu ựỏ là dương tắnh. Chuyển màu vàng có thể chúng khử ựến N2 (1 số trường hợp sinh hơi ở ựáy) cho thêm 2- 3mg Zn vào ống GLU. Sau 5 phút nếu ống chuyển lại màu vàng là phản ứng sinh khắ N2 là dương tắnh; nếu ống chuyển màu da cam ựến ựỏ là âm tắnh.
+ đối với môi trường OF: Dùng que cấy ựã ựược hơ nóng và ựể nguội, lấy vi khuẩn và chọc thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường OF, nuôi trong tủ ấm 24 giờ và ựọc kết quả.
* Thử phản ứng sinh hóa bằng kit thử API 20 STREP
Các bước tiến hành tương tự bộ kắt thử API 20E nhưng dùng ựể ựịnh danh các loại vi khuẩn Streptococcus.
* Phân loại vi khuẩn:
- Theo tiêu chuẩn chung: ựi từ họ, giống ựến tiêu chuẩn ựặc trưng cho loài.
- Dựa vào những ựặc ựiểm và kết quả thử phản ứng sinh hoá, phân loại vi khuẩn dựa vào bảng phân loại vi khuẩn, cẩm nang phân loại vi khuẩn của B. Austin and D. A. Austin (1987) và Nicky B. Buller (2004).