- Mẫu nghiên cứu gồm: BB1, BB2, BB3, BB4, BB5.
- Mẫu đối chứng: dùng Quercetin.
Tiến hành thí nghiệm: nhƣ mục 2.4.4.
Kết quả:
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm sàng lọc tác dụng chống oxy hóa
in vitro, với thử nghiệm dọn gốc tự do superoxyd nhận thấy BB4, BB5 thể hiện tác dụng kém. Ở nồng độ 80μg/ml vẫn chƣa thể hiện tác dụng ức chế superoxyd.
Kết quả sàng lọc của các chất BB1, BB2, BB3 cho thấy chúng đều có tác dụng dọn gốc tự do superoxyd, trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.5.
Bảng 3.9: Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd của các chất BB1, BB2, BB3
Mẫu thử Hoạt tính loại bỏ gốc tự do (%) IC50
(µg/ml) 80µg/ml 40µg/ml 30µg/ml 20µg/ml 10µg/ml 5µg/ml
BB1 100 98,2 61,6 38,2 19,2 7,4 23,04
BB2 99,8 71,01 52,4 28,3 11 2 29,54
48
Bảng 3.10: Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd của chất Quercetin
Mẫu thử Hoạt tính loại bỏ gốc tự do (%) IC50
(µg/ml) 20µg/ml 10µg/ml 5µg/ml 2,5µg/ml 1,25µg/ml Quercetin 94 87,7 70,1 40,8 20,3 3,40 Hình 3.5:Đồ thị kết quả tác dụng dọn gốc tự do superoxyd của các chất BB1, BB2, BB3 và Quercetin Nhận xét: - Các chất BB4, BB5 có tác dụng dọn gốc tự do superoxyd kém ở mức nồng độ thí nghiệm.
- So sánh giá trị IC50 của các chất thử cho kết quả tăng dần nhƣ sau:
BB1 < BB2 < BB3.
- Đồ thị kết quả cho thấy tất cả các chất phân lập đƣợc đều có tác dụng dọn gốc tự do superoxyd kém hơn Quercetin (IC50 = 3,40 μg/ml).
- Chất BB1 có hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd cao nhất (IC50 = 23,04 μg/ml).
49
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Các chất phân lập đƣợc
Qua kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cho thấy phân đoạn ethyl acetat có tác dụng mạnh nhất. Vì vậy, để nghiên cứu kỹ hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Viễn chí đuôi vàng, chúng tôi tiến hành phân lập chất từ phân đoạn này. Kết quả thu đƣợc 5 chất BB1, BB2, BB3, BB4 và BB5. Từ việc so sánh các dữ liệu phổ UV, phổ IR, phổ ESI-MS, phổ
1
H-NMR, phổ 13C-NMR, nhiệt độ nóng chảy với tài liệu tham khảo của từng chất, chúng tôi xác định đƣợc các chất trên đều là các xanthon có tên nhƣ sau:
BB1: 1,7-dihydroxy-4-methoxy xanthon
BB2: 1,3-dihydroxy xanthon
BB3: 1,7- dihydroxy xanthon
BB4: 1-methoxy-2,3-methylendioxy xanthon
BB5: 1,7- dimethoxy xanthon
Trong đó BB1, BB2, BB3 đều là các polyphenol, với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với gốc tự do thành một gốc tự do mới bền hơn. Do đó, các hợp chất này thƣờng có hoạt tính chống oxy hóa.
Đây là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới công bố phân lập đƣợc các chất
BB1, BB3, BB5 từ loài Polygala fallax. Các nghiên cứu trƣớc đây mới chỉ phân lập đƣợc 3 chất này từ các loài khác cũng thuộc chi Polygala. Các chất
BB2 và BB4 đã từng đƣợc Lin li-lin, Li Yao-lan phân lập từ loài này vào năm 2005, 2009.
Trong năm chất phân lập đƣợc thì BB1, BB2, BB3 cũng đã đƣợc phân lập từ loài Polygala karensium và 2 loài này đều có xanthon chính là 1,7- dihydroxy xanthon. Vậy có thể sơ bộ kết luận, 2 loài Polygala fallax và
50
Polygala karensium không chỉ giống nhau về hình dáng, mà chúng còn có thành phần hóa học khá giống nhau. Điều này góp phần lý giải vì sao dân gian lại dùng 2 loài này với cùng công năng chủ trị.
Đây là một đóng góp mới của luận văn góp phần nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của rễ cây Viễn chí đuôi vàng.
4.2. Về tác dụng sinh học của các chất phân lập đƣợc
Ngày nay, mặc dù điều kiện và chất lƣợng sống ngày càng đƣợc cải thiện, nhƣng con ngƣời lại phải đối mặt với rất nhiều loại bệnh nguy hiểm nhƣ các bệnh về tim mạch, bệnh gan, tiểu đƣờng, thần kinh… Đặc biệt là bệnh ung thƣ với mức độ gia tăng nhanh chóng. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, y học và các ngành có liên quan, các nhà khoa học đã chỉ ra một trong các nguyên nhân chính làm phát sinh bệnh tật là do sự gia tăng quá mức của các gốc tự do trong cơ thể [12]. Vì vậy xu hƣớng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxy hóa ngày càng đƣợc chú trọng trong ngành Y Dƣợc.
Vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm các thuốc chống oxy hóa có hiệu quả trong điều trị, dự phòng ngăn chặn các tổn thƣơng mô do gốc tự do gây ra.
Theo xu hƣớng nghiên cứu này, kết hợp với tham khảo tài liệu và kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, chúng tôi tiến hành nghiên cứu dƣợc liệu rễ Viễn chí đuôi vàng với tác dụng chống oxy hóa.
Có rất nhiều thử nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxy hóa nhƣ: thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, gốc tự do superoxid, gốc tự do hydroxyl, gốc tự do hydroperoxyl, chống peroxyd hóa lipid, phƣơng pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa bằng xác định chỉ số Iod … Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng một phƣơng pháp thì không thể đánh giá hoàn toàn hoạt tính chống oxy hóa của một chất, do gốc tự do đƣợc sinh ra bởi nhiều cơ chế khác nhau. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 2 phƣơng pháp: dọn gốc tự do DPPH và
51
gốc tự do superoxid để đánh giá tác dụng của 5 xanthon phân lập từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng.
- Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH: với năm nồng độ thí nghiệm (5 μg/ml - 80 μg/ml) của các chất BB1, BB2, BB3, BB4, BB5 đều thể hiện tác dụng dọn gốc DPPH yếu có kết quả tăng dần nhƣ sau BB5 < BB4 < BB3 < BB2 < BB1. % ức chế DPPH ở nồng độ cao nhất của các chất đều chƣa đƣợc 25%. Do đó không tiến hành xác định IC50.
- Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxyd: kết quả cho thấy 3 chất BB1, BB2, BB3 có tác dụng chống oxy khá tốt với IC50 lần lƣợt là: 23,04 μg/ml, 29,54 μg/ml, 38,32 μg/ml. Tuy nhiên, chúng đều có tác dụng dọn gốc tự do superoxyd kém hơn nhiều so với quercetin (IC50 = 3,40 μg/ml). Bên cạnh đó các chất BB4, BB5 thể hiện tác dụng yếu, ở nồng độ 80μg/ml vẫn chƣa thể hiện tác dụng ức chế superoxyd.
Vậy thực nghiệm đã cho thấy 5 xanthon tách đƣợc từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng có hoạt tính chống oxy hóa khá yếu. Vậy không nên tiếp tục nghiên cứu tác dụng này ở các xanthon tách từ rễ Viễn chí đuôi vàng mà có thể thử các tác dụng khác nhƣ chống viêm, giảm đau...
Lin và cộng sự cũng thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của 7 xanthon: 1,7-dihydroxy-2,3-methylendioxy xanthon (2); 7-hydroxy-1- methoxy-2,3-methylendioxy xanthon (3); 1,3-dihydroxy-2-methoxy xanthon (5); 1-methoxy-2,3-methylendioxy xanthon (6-BB4); 3-hydroxy-1,2- dimethoxy xanthon (7); 1,6,7-trihydroxy-2,3-dimethoxy xanthon (8); 1,3,7- trihydroxy-2-methoxy xanthon (9) tách từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng trên 4 mô hình: dọn gốc tự do H2O2, chống peroxy hóa lipid, dọn gốc tự do hydroxyl, dọn gốc tự do oxy hóa ROS do giải phóng oxy nhanh chóng từ đại thực bào với 2 nồng độ là 2µg/mL và 10µg/mL [23]. 7 xanthon trên thể hiện tác dụng chống oxy hóa khác nhau trên các mô hình khác nhau. Với mô hình dọn gốc tự do H2O2 tác dụng các chất lần lƣợt là: 8 < 7 < 6 < 5 < 3 < 2; với
52
mô hình chống peroxy hóa lipid tác dụng các chất lần lƣợt là: 5 < 3 < 7 < 6 < 9 < 8 < 2; với mô hình 3 tác dụng các chất lần lƣợt là: 7 < 6 < 3 < 2 < 5 < 8; với mô hình 4 tác dụng các chất lần lƣợt là: 9 < 8 < 5. Riêng với chất BB4 ở 10µg/mL dọn đƣợc 42% gốc tự do H2O2 và với mô hình chống peroxy hóa lipid ở 2 nồng độ 10µg/mL và 100µg/mL BB4 dọn đƣợc 9,0% - 53,2% [23]. Chất BB3, BB4 đã đƣợc thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa trên các mô hình dọn gốc tự do H2O2 với 2 nồng độ 2µg/mL và 10µg/mL có % tác dụng lần lƣợt nhƣ sau: BB3: 50,3%-66,3%; BB4: 32,7%-58,6% [28].
Từ kết quả thực nghiệm và kết quả nghiên cứu của Lin, chúng ta thấy rằng các xanthon có tác dụng chống oxy hóa rất khác nhau. Và với mỗi xanthon ở trong các mô hình nghiên cứu khác nhau cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa khác nhau. Vì vậy để nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của một xanthon ta cần thử trong nhiều mô hình. Các kết quả nghiên cứu ở trên cũng chƣa cho thấy có hay không ảnh hƣởng của nhóm chức phenol tới tác dụng chống oxy hóa của xanthon. Vì vậy cần có các nghiên cứu rõ ràng hơn về sự ảnh hƣởng này.
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài: “Phân lập và thử tác dụng chống oxy hóa của các xanthon từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl.) họ Viễn chí Polygalaceae” bƣớc đầu chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
* Phân lập chất tinh khiết
Đã phân lập đƣợc 5 chất có độ tinh khiết cao bằng phƣơng pháp sắc ký cột từ phân đoạn ethyl acetat.
Đã xác định công thức cấu tạo của 5 chất phân lập đƣợc. Chúng đều là các xanthon có tên nhƣ sau:
BB1: 1,7-dihydroxy-4-methoxy xanthon
BB2: 1,3-dihydroxy xanthon
BB3: 1,7- dihydroxy xanthon
BB4: 1-methoxy-2,3-methylendioxy xanthon
BB5: 1,7- dimethoxy xanthon
* Về tác dụng sinh học của các chất phân lập được
Đã thử nghiệm tác dụng chống oxy với 2 mô hình là: dọn gốc tự do DPPH và dọn gốc tự do superoxyd của các chất BB1, BB2, BB3, BB4, BB5
đƣợc phân lập từ dƣợc liệu Viễn chí đuôi vàng.
Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH các chất BB1, BB2, BB3, BB4, BB5
thể hiện tác dụng yếu.
Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxyd: kết quả cho thấy 3 chất BB1, BB2, BB3 có tác dụng chống oxy khá tốt với IC50 lần lƣợt là: 23,04 μg/ml, 29,54 μg/ml, 38,32 μg/ml. Bên cạnh đó các chất BB4, BB5 thể hiện tác dụng yếu, ở nồng độ 80μg/ml vẫn chƣa thể hiện tác dụng ức chế superoxyd.
54
Kiến nghị
1. Tiếp tục phân lập hoạt chất trong dƣợc liệu Viễn chí đuôi vàng.
2. Tiếp tục nghiên cứu các tác dụng khác của cao chiết các phân đoạn và các chất phân lập đƣợc để làm cơ sở cho việc đƣa dƣợc liệu Viễn chí đuôi vàng sử dụng trong y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đàm Trung Bảo (2001), “Các gốc tự do”, Tạp chí Dược học, số 6, tr. 29-30.
2. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 303-304, 730 – 732.
3. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt nam, quyển 1, tr. 119, 988, NXB Y học, Hà Nội.
4. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 2, tr. 349, NXB Trẻ, Hà Nội.
5. Viện Dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
6. Viện Dƣợc liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, tr. 279-293, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Viện Dƣợc liệu (2010). Hội thảo Dự án Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền. Thừa thiên Huế, tháng 4 – 2010.
8. Nguyễn Văn Nguyên, Vũ Mạnh Hùng (2000), “Oxydant và antioxidant trong bệnh lý”, Một số vấn đề khoa học Y khoa trong thế kỷ 21, tr. 91- 97.
9. Đỗ Thanh Xuân, Trần Văn Quốc, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung (2011), “Phân lập hai hợp chất tinh khiết từ vỏ trái măng cụt (Garcinia mangostanal) và thử hoạt tính của chúng”, Tạp chí Khoa học, 18a, tr. 153-160.
2
Tiếng Anh
10. Dele Farrell (2006), “Xanthon-the super antioxidant”, Pacific Northwest’s jounral of conscious living, march/April.
11. Dongming Zhang, Tochio Miyase (1997), “Oligosaccharide polyesters from roots of Polygala fallax”, Phytochemistry, 45(4), pp. 733-741.
12. Douglas Darr, Irwin Fridovich (1994), “Free radicals in cutaneous biology”, Investigative Dermatology, 102(5), pp. 671-675.
13. G. Alagumanivasagam, R. Pasupathy, A. Kottaimuthu and R.Manavalan (2012), “A Review on In-vitro Antioxidant Methods”,
International journal of pharmaceutical and chemical sciences, 1 (2), 4-6/2012, pp. 662-674.
14. Guo JiYuan, Wang QiuJuan, Wu JinHui, Zhu DanNi (2006), “Studies on the protective effect of saponins from Polygala aureocauda on animal models of liver injury”,Chinese Journal of Natural Medicines, 4(4), pp. 303-307.
15. Gou Jinshen et al (1992), “Effect of Polygala aureocauda Dunn. on the function of miocardium in experimental animal”, Jounral of traditional medicin university of hunan, 12(3).
16. Halliwell B. (1995), “Antioxidant characterization methodology and mechanism”, Biochemical Pharmacology, 49, pp. 1341-1348.
17. Hesham A. El-Beshbishy,Ahmed M. Mohamadin,Ashraf B. Abdel- Naim (2009),“In VitroEvaluation of the Antioxidant Activities of Grape Seed (Vitis vinifera) Extract, Blackseed (Nigella sativa) Extract and Curcumin”, Medical sciences, 4(1), pp. 23-25.
18. Huang Zhaohui,Xu Kangping,Zhou Yingjun,Hu Gaoyun,Tan Guishan (2005), “Studies on chemical constituents of Polygala aureocauda”, Natural Product Research and Development, 17(3), pp. 298-300.
3
19. Hui H.Z., Ping X.K., Jun Z.Y., Yun, H.G., Shan, T.G (2004), “A new xanthone from Polygala aureocauda Dunn.”, Acta Pharmaceutica Sinica, 39(9), pp. 752-754.
20. Hyun Ahjung, Baoning Su (2006), “Antioxidant xanthones from the Pericarp of Garcinia mangostana (Mangosteen)”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, pp. 2077−2082.
21. J. S. Negi, V. K. Bisht, P. Singh, M. S. M. Rawat, G. P. Joshi (2013), “Naturally Occurring Xanthones: Chemistry and Biology”, Journal of Applied Chemistry, pp. 621459-621462.
22. Kou J, Ma R, Zhu D, Yan Y (2003), “Blood-activating and anti- inflammatory actions of Polygala fallax”,Journal of Chinese Medicinal Materials, 26(4), pp. 268-271.
23. Kou Jun-Ping, Li Jing-Feng, Yan Jin, Zhu Dan-Ni (2003), “Effect of total saponin from root of Polygala fallax Hesml. (PTS) on coagulation and thrombosis”, Journal of China Pharmaceutical Universit, pp. 257- 259.
24. Kuan L.C. (2012), Synthenis and characterization of 1,3-dihydroxy xanthone derivatives and their antioxidant activities, Bachelor of science (Hons.) Chemistry, Faculty of Science university Tuku Abdul Rahman.
25. Li Hao, Wang QiuJuan, Wu JinHui, Zhu DanNi (2004), “Studies on the lipid-regulating effects of saponins from Polygala aureocauda”, Chinese Journal of Natural Medicines, 2(2), pp. 115-118.
26. Li H, Wang QJ, Zhu DN, Yang Y (2008), “Reinioside C, a triterpene saponin of Polygala aureocauda Dunn., exerts hypolipidemic effect on hyperlipidemic mice”, Phytotherapy Research, 22(2), pp. 159-164.
4
27. Li L.;, Ni, Z.d.; Qin, Y.Y. (2002), “RP-HPLC Determination of Two Different Xanthone in Polygala fallax Heml.”, Journal of China Pharmaceutical University, 1, pp. 42-44.
28. Lin li-lin, Huang feng, Chen Si-bao (2005), “Xanthones from the roots of Polygala caudata and their antioxidation and vasodilatation activities in vitro”, Planta medica, 71, pp. 372-375.
29. Lin li-lin, Huang feng, Chen Si-bao (2005), “Chemical constituents in root of Polygala fallax and their antioxidation activities in vitro”, China Journal of Chinese Materia Medica, 30, pp. 827-830.
30. Li TZ,Zhang WD,Yang GJ,Liu WY,Liu RH,Zhang C,Chen HS (2006), “New flavonol glycosides and new xanthone from Polygala japonica”, Journal of Asian Natural Products Research, 8(5), pp. 401- 409.
31. Li Yao-lan, Dai Jie, Huang Wei-huan, Cen Ying-zhou, Zhang Xiao- qi,Ye Wen-cai (2009), “Chemical constituents and antiviral activity of
Polygala fallax”, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 3, pp. 345- 348.
32. Miwako Kondo, Liliang Zhang (2009), “Bioavailability and antioxidant effects of a xanthone - Rich Mangosteen (Garcinia mangostana) product in humans”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, pp. 8788–8792.
33. Miyase T,Noguchi H,Chen XM (1999), “Sucrose esters and xanthone C-glycosides from the roots of Polygala sibirica”, Journal of Natural Products, 62(7), pp. 993-996.
34. Ni Z.D., Li L., Jun Z.Y., Qing Y.Y. (2003), “Chemical constituents from the root of Polygala fallax Hemsl.”, Journal of China Pharmaceutical University, 3, pp. 222-224.
5
35. Philip Molyneux (2004), “The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity”,
Songklanakarin Journal of Science Technology, 26(2), pp. 211-219.
36. Qiang Z.J., Bin D., Feng F. (2009), “Chemical constituents from root of Polygala fallax”, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 6, pp.