Theo một số nghiên cứu trên thế giới về 2 loài Polygala fallax và
Polygala karensium, các xanthon đều đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat [29], [43]. Vì vậy đề tài lựa chọn cắn VCE để phân lập chất tinh khiết.
Kết quả
Quá trình sắc ký thu đƣợc 5 phân đoạn ký hiệu lần lƣợt là: PĐ1 (1,26 g); PĐ2(2,30 g); PĐ3(6,5 g); PĐ4 (3,2 g); PĐ5(5,88 g) và phần dội cột bằng 100 % methanol.
Phân lập PĐ3:
+ Từ phân đoạn PĐ3 (6,5 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 3 cm x 60 cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt (0,040- 0,063 mm, Merck), dung môi rửa giải là hỗn hợp 2 dung môi hexan : ethyl acetat (20 : 1→5 : 1). Hứng dịch rửa giải vào bình nón 50 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu đƣợc 3 phân đoạn: PĐ3-1 (0,94 g); PĐ3-2 (1,01 g); PĐ3-3 (1,54 g); PĐ3-4 (1,04 g).
+ Phân đoạn PĐ3-2 (1,01 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 2 cm x 60 cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt (0,040- 0,063 mm, Merck), dung môi rửa giải đẳng dòng bằng hỗn hợp 2 dung môi hexan : ethyl acetat (10 : 1). Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 10 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Gộp các ống sạch chỉ có 1 vết duy nhất. Sau khi bay hơi hết dung môi, thấy xuất hiện các tinh thể hình kim, màu vàng - BB3 (116 mg).
+ Từ phân đoạn PĐ3-3 (1,54 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 2cm x 60cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt (0,040- 0,063 mm, Merck), dung môi rửa giải là hỗn hợp 2 dung môi hexan : ethyl acetat (12:1→6:1). Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 20 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng
31
SKLM. Gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu đƣợc 2 phân đoạn: PĐ3-3-1 (0,52 g); PĐ3-3-2 (0,24 g).
+ Phân đoạn PĐ3-3-1 (0,25 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 1 cm x 60 cm, với silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), dung môi rửa là hỗn hợp 2 dung môi methanol : nƣớc. Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 10 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Xuất hiện các ống chỉ có 1 vết duy nhất, gộp lại với nhau. Sau khi bay hơi hết dung môi, thấy xuất hiện các tinh thể hình kim, màu vàng nhạt - chất BB2 (36 mg).
+ Phân đoạn PĐ3-3-2 (0,54 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột pha đảo nhƣ phân đoạn PĐ3-3-1. Thu đƣợc tinh thể hình kim, màu vàng đậm - chất BB1 (7 mg).
Phân lập PĐ4:
+ Phân đoạn PĐ4 (3,2 g) đƣợc tiếp tục sắc ký trên cột kích thƣớc 4cm x 60cm, với hạt Sephadex. Hệ dung môi rửa giải là nƣớc : methanol với tỷ lệ giảm dần độ phân cực từ 100:1-1:100. Quá trình sắc ký thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ: PĐ4-1 (1,82 g); PĐ4-2 (0,77 g); PĐ4-3 (0,58 g).
+ Phân đoạn PĐ4-2 (0,77 g); PĐ4-3 (0,58 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 1cm x 60cm, với silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), dung môi rửa là hỗn hợp 2 dung môi methanol : nƣớc. Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 10 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Xuất hiện các ống chỉ có 1 vết duy nhất, gộp lại với nhau. Từ phân đoạn PĐ4- 2, sau khi bay hơi hết dung môi, thấy xuất hiện kết tinh vô định hình, màu trắng - chất BB4 (5 mg). Phân đoạn PĐ4-3, sau khi bay hơi hết dung môi, cũng cho kết tinh vô định hình, màu trắng - chất BB5 (5 mg).
32
Tóm tắt quy trình phân lập chất theo sơ đồ sau