Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl (OH•) [6], [13], [42]
Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên phản ứng oxy hóa đƣờng 2- deoxiribose của gốc OH•. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đƣờng 2-deoxiribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloyldialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 532 nm. Khi đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch phản ứng ở bƣớc sóng này sẽ cho ta biết nồng độ MDA đƣợc tạo ra
18
sau quá trình oxy hóa. Từ đó ta tính đƣợc mức độ deoxiribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do OH• của mẫu thử.
Ƣu điểm: nhanh, dễ thực hiện, rẻ tiền. Tuy nhiên, gốc OH• có hoạt tính rất mạnh nên rất khó đánh giá mức độ tác dụng dọn gốc của các chất thử và kết quả ít chính xác hơn các thí nghiệm trên.
Phương pháp sàng lọc (Screening test) [6], [13]
Để xác định chất chống oxy hóa trong thực vật, một số tác giả đã xây dựng phƣơng pháp sàng lọc – Screening test, thực chất đó là phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng.
Phƣơng pháp này chỉ mang tính chất phát hiện hay định tính, tức là chỉ biết mẫu thử có tác dụng chống oxy hóa hay không chứ không có ý nghĩa đánh giá về mặt định lƣợng.
Phương pháp định lượng Malonyldialdehyd (MDA) [6], [13]
Nguyên tắc: Tiến hành peroxy hóa acid béo chƣa no ở một nhiệt độ nhất định. Sau một khoảng thời gian phản ứng tạo ra MDA. MDA phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra phức màu hồng hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 532 nm. Đo cƣờng độ màu biết lƣợng MDA trong mẫu đo. Mẫu thử có chất chống oxy hóa thi MDA thấp hơn mẫu đối chứng.
Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa bằng xác định chỉ số Iod [6], [13]
Nguyên tắc: Tiến hành peroxy hóa Tween 80 ở một nhiệt độ và thời gian nhất định, acid oleic trong Tween 80 bị cắt giảm dây nối đôi vì vậy chỉ số Iod của acid oleic bị giảm. Ta xác định chỉ số Iod của Tween 80 sau phản ứng peroxy hóa khi ủ dịch chiết thuốc và không có dịc chiết thuốc. Nếu mẫu thử (mẫu có dịch chiết thuốc) có chất chống oxy hóa thì chỉ số Iod bị giảm ít hơn mẫu chứng (mẫu không có dịch chiết thuốc).
Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa bằng cách đo các dien liên hợp [6], [13]
19
Nguyên tắc: Hệ dien liên hợp hấp thu ánh sáng ở bƣớc sóng 230-240 nm. Nếu lấy dịch chiết lipid của một tổ chức nghiên cứu và đo độ hấp thụ ánh sáng ở 230-240 nm có thể suy ra hàm lƣợng L•, LO•, LOO•, và LOOH. Nhƣng vì các gốc L•, LO•, LOO• ít bền nên kết qủa của phép đo chủ yếu là LOOH.
Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa bằng cách đo hydroperoxyd (LOOH) [6], [13]
Nguyên tắc: dựa vào khả năng các LOOH có thể chuyển I1 thành I2. Định lƣợng I2 bằng Natri thiosulfat ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc điểm tƣơng đƣơng của phép đo chuẩn độ này bằng cách chuẩn độ ampe kế, hoặc qua sự đổi màu của hồ tinh bộ hoặc đo quang 380 nm.
20
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Đối tƣợng nghiên cứu là rễ cây Viễn chí đuôi vàng đƣợc thu hái tại Sa Pa vào tháng 9 năm 2013, do nghiên cứu sinh Đoàn Thái Hƣng thu mẫu. Mẫu nghiên cứu đã đƣợc xác định tên khoa học là Polygala fallax Hemsl. bởi tiến sỹ Nguyễn Thị Thanh Hƣơng, Phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Rễ cây sau khi thu hái đƣợc rửa sạch đất cát, thái mỏng, sấy khô ở 50- 55 oC, bảo quản bằng bao tải trong phòng thoáng mát, không mối, mọt.
A B
Hình 2.1: Hình ảnh của dƣợc liệu Viễn chí đuôi vàng A: Dƣợc liệu tƣơi; B: Dƣợc liệu khô
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị
-Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO). -Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)
-Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M). -Tủ sấy (Memmert, ULM 500).
21
-Máy cất quay chân không (Buchii, Rotavapor R – 220) -Cột thuỷ tinh dùng cho sắc ký cổ điển.
-Đèn tử ngoại 2 bƣớc sóng 254 nm, 365 nm (Vilber lourmat, CN – 15 – LC).
-Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E
-Máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 nicolet
-Máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên.
-Brruke AM500FT-NMR spectrometer của Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các dụng cụ thông thƣờng ở phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hóa chất
2.2.2.1. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất
-Hexan (Hex), dichloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), aceton, n-butanol (BuOH) đạt tiêu chuẩn phân tích.
-Bản sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 GF254 (Merck) và bản mỏng Silica gel 60 RP18 F254S (Merck).
-Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck). - Silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) - Gel Sephadex LH 20
-Thuốc hiện màu dùng trong sắc ký lớp mỏng (dung dịch acid H2SO4 1 %)
2.2.2.2. Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học
-1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) của hãng Sigma (Mỹ) -Xanthin của hãng Merck.
22
-Enzym xanthin oxidase của hãng Merck. -Đƣờng 2-deoxyribose của hãng Merck.
-Triclo acetic acid (TCA) và thiobarbituric acid (TBA) của hãng Merck.
-Kali dihydrophosphat của hãng Merck.
-Muối sulfat kép của Sắt (II) và amoni (muối Mo) của hãng Merck. -Chứng dƣơng quercetin của hãng Sigma (Mỹ).
2.3. Thiết kế nghiên cứu
Bƣớc 1: Chiết cao các phân đoạn của dƣợc liệu rễ cây Viễn chí đuôi vàng.
Chiết xuất cao toàn phần.
Chiết lỏng lỏng để thu đƣợc cao các phân đoạn.
Bƣớc 2: Phân lập, tinh chế (độ tinh khiết > 90 %) và xác định công thức hóa học của các chất phân lập từ phân đoạn này.
Phân lập, tinh chế bằng các phƣơng pháp sắc ký (sắc ký cột, kết tinh).
Xác định công thức bằng các phƣơng pháp phổ (UV, IR, MS, NMR).
Bƣớc 3: Xác định khả năng chống oxy hóa của từng chất phân lập ở trên. + Tác dụng dọn gốc tự do DPPH
+ Tác dụng dọn gốc tự do superoxide anion
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Chiết xuất cao các phân đoạn * Chiết xuất * Chiết xuất
Sử dụng ethanol 90 % để chiết xuất dƣợc liệu. Sau đó cao toàn phần đƣợc tiếp tục chiết lỏng lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau từ kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực lần lƣợt là: n- hexan, ethyl
23
acetat, n- butanol. Thu đƣợc 4 phân đoạn dịch chiết: phân đoạn n- hexan (VCH), phân đoạn ethyl acetat (VCE), phân đoạn n-butanol (VCB) và phân đoạn nƣớc (VCN).
2.4.2. Phân lập
* Phương pháp phân lập các chất:
Phương pháp sắc ký cột
Pha tĩnh
Silica gel pha thƣờng (0,04-0,063 mm, Merck)
Cân silica gel, hoạt hóa ở nhiệt độ 1100 trong 1 giờ. Chất hấp phụ đƣợc để đến thật nguội trong bình hút ẩm.
Chuẩn bị cột sắc ký
Cột sắc ký là một cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy, kích thƣớc tùy lƣợng cao phân lập. Cột đƣợc rửa sạch, sấy khô, gắn trên một giá vững chắc.
Pha động
Dung môi rửa giải là hexan, ethyl acetat, methanol, nƣớc…
Phƣơng pháp nhồi ƣớt
Cột sắc ký đƣợc lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột để ngăn cho chất hấp phụ chảy xuống khi mở khóa cột.
Chất hấp phụ là silica gel pha thƣờng, đƣợc hòa trong một lƣợng dung môi hexan tạo thành hỗn dịch tƣơng đối loãng, sau đó đƣợc rót cẩn thận vào trong cột đã chứa một lớp dung môi hexan trên lớp bông. Mở khóa cột tối đa, loại trừ bong bóng khí bằng cách rót từ từ và thƣờng xuyên vỗ nhẹ cột bằng quả bóp cao su.
Ổn định cột: nén cột bằng quả bóp cao su gõ nhẹ đều quanh cột đến khi không còn bọt khí trong cột, mặt thoáng phẳng và lớp silica gel lắng xuống đã ổn định.Tiếp cho dung môi hexan chảy qua cột khoảng 2 giờ, thì khóa cột lại.
24
Chuẩn bị mẫu sắc ký
Cao chiết thu đƣợc trong quá trình chiết xuất dƣợc liệu đƣợc hòa tan trong 1 lƣợng tối thiểu dung môi. Sau đó trộn với một lƣợng silica gel thích hợp, thu hồi hết dung môi trong máy cô áp xuất giảm đến khô, đƣợc khối bột mịn tơi xốp.
Đƣa mẫu lên cột và tiến hành sắc ký
Cột sắc ký đã ổn định đƣợc mở khóa cho dung môi trên cột chảy xuống cách bề mặt silica gel một khoảng 5 cm sau đó khóa cột lại. Tiến hành rắc đều toàn bộ mẫu sắc ký đã chuẩn bị lên cột, gõ nhẹ xung quanh thành cột cho bột mẫu lắng xuống từ từ, khi đã ổn định thì mở khóa cột. Rửa lớp bột bám trong lòng cột bằng dung môi hexan.
Tiến hành sắc ký với hệ dung môi đã lựa chọn . Phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký.
Dịch thu đƣợc trong quá trình rửa giải đƣợc hứng vào bình hoặc ống nghiệm tƣơng ứng. Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 GF254 (Merck) và bản mỏng silica gel RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH. Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, thu hồi dung môi.
Ngoài ra còn có các cột sắc ký silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20.
- Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 GF254 (Merck) và bản mỏng silica gel RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH.
* Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các thông số vật lý và các phƣơng pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ UV-VIS, phổ hồng
25
ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (nếu cần)-1D và 2D NMR.
- Điểm chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage; Phổ tử ngoại đƣợc ghi trên máy UV-VIS Cary 1E; Phổ hồng ngoại đƣợc đo dƣới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 Nicolet; Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) đƣợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc đo trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chất nội chuẩn là tetramethyl silan.
2.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học của các chất phân lập từ Viễn chí đuôi vàng
Thử tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro
Mẫu nghiên cứu gồm: các chất phân lập đƣợc từ Viễn chí đuôi vàng.
Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH [6], [13], [42]
* Nguyên tắc của phương pháp
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dƣợc liệu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng λ= 517 nm.
* Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc tự do sang trạng thái ổn định. Nhƣ vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm.
26 NO2 NO2 O2N N N . 1: Diphenylpicrylhydrazyl (gốc tự do) NO2 NO2 O2N HN N 2: Diphenylpicrylhydrazine Tiến hành
+ Pha dung dịch DPPH: Lấy 2mg DPPH pha trong 16,9 ml methanol đƣợc dung dịch 1. Từ dung dịch 1 pha loãng gấp đôi đƣợc dung dịch có nồng độ 150 μM.
+ Quercetin (chất đối chiếu). + Hỗn hợp phản ứng gồm:
90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol) 10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)
Hỗn hợp phản ứng đƣợc lấy nhƣ thể hiện ởbảng 2.3 Bảng 2.1: Hỗn hợp phản ứng
Ống Mẫu thí nghiệm (μl) Methanol (μl) DPPH (μl)
Trắng - 100 -
Chứng - 10 90
Thử 10 - 90
+ Để hỗn hợp phản ứng trong bóng tối 30 phút ở 30oC. Sau đó đo giá trị mật độ quang (OD) bằng máy UV-VIS Cary 1E tại bƣớc sóng 517 nm.
Tất cả các mẫu đƣợc thực hiện 3 lần.
Tính kết quả
Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH (DPPH radical scavenging activity) đƣợc tính theo công thức
27
Trong đó:
Ab: mật độ quang của mẫu trắng Ac: mật độ quang của mẫu chứng As: mật độ quang của mẫu thử.
Để xác định giá trị IC50, là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế đƣợc 50 % giải phóng các gốc tự do, mỗi mẫu thử có tác dụng đƣợc pha thành 5 thang nồng độ. Giá trị IC50 của các mẫu đƣợc tính bởi phƣơng pháp hồi qui không tuyến tính của đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự do DPPH tƣơng ứng với mỗi nồng độ của mẫu thử.
Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxyd [6], [13], [42]
Tiến hành:
Trong mỗi ống mẫu thử thêm các dung dịch vào theo trình tự nhƣ sau: - 50 µl dung dịch xanthin 4 mM
- 50 µl thuốc thử NBT 225 µM
- 50 µl đệm phosphat (pH 7,8 có thêm EDTA 1 mM) - 10 µl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau.
- 40 µl xanthin oxydase hoạt độ 1 đơn vị/mg
Để ổn định ở nhiệt độ phòng 5 phút và đo quang ở bƣớc sóng λ = 550 nm. Tiến hành thực hiện song song với ống chứng (thay 10 µl mẫu thử bằng 10 µl đệm phosphat) và ống trắng (không có thuốc thử NBT, thay bằng 50 µl đệm phosphat).
Hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd (superoxide radical scavenging activity – SRSA) đƣợc tính theo công thức:
O2 •
scavenging activity (%) = 100×(Ac – As)/(Ac – Ab)
Trong đó:
Ab: mật độ quang của mẫu trắng Ac: mật độ quang của mẫu chứng As: mật độ quang của mẫu thử.
28
Tác dụng ức chế của mẫu thử đƣợc đánh giá theo trị số IC50, là giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) tại đó mẫu thử ức chế 50 % sự tạo thành gốc tự do.
29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất cao các phân đoạn
Rễ Viễn chí đuôi vàng đã phơi khô (5 kg) nghiền thành bột thô (0,5-1,5 cm), chiết nóng 3 lần mỗi lần với 12 lít EtOH 90% trong bình dung tích 20 lít ở nhiệt độ 700
C. Gộp các dịch chiết EtOH thu đƣợc đem cất loại dung môi thu đƣợc 386 g cao chiết (VCTP). Hòa tan cao toàn phân trong lƣợng tối thiểu nƣớc (khoảng 500 ml) sau đó chiết phân bố lắc lần lƣợt với các dung môi n – hexan, ethylacetat và n – butanol (tỷ lệ 1:1, mỗi dung môi 3 lần) thu đƣợc dịch chiết tƣơng ứng. Cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc các cao tƣơng ứng là cao hexan - VCH, cao Ethylacetat - VCE, cao butanol - VCB, cao nƣớc - VCN. Quy trình chiết đƣợc tóm tắt ở sơ đồ sau.
Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn cao rễ Viễn chí đuôi vàng
VCB (86,16 g) VBN (197,7 g) Dƣợc liệu VCTP (386 g) VCH (4 g)
Chiết với EtOH 90% Thu hồi dung môi
Phân đoạn nƣớc Lắc phân đoạn với ethylacetat VCE (50,9 g) Hòa trong nƣớc
Lắc phân đoạn với n – hexan
Lắc phân đoạn với BuOH
p/đ nƣớc
30
3.3. Phân lập các chất
3.3.1. Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột
Theo một số nghiên cứu trên thế giới về 2 loài Polygala fallax và
Polygala karensium, các xanthon đều đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat [29], [43]. Vì vậy đề tài lựa chọn cắn VCE để phân lập chất tinh khiết.
Kết quả
Quá trình sắc ký thu đƣợc 5 phân đoạn ký hiệu lần lƣợt là: PĐ1 (1,26 g); PĐ2(2,30 g); PĐ3(6,5 g); PĐ4 (3,2 g); PĐ5(5,88 g) và phần dội cột bằng 100 % methanol.
Phân lập PĐ3:
+ Từ phân đoạn PĐ3 (6,5 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 3 cm x 60 cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt (0,040- 0,063 mm, Merck), dung môi rửa giải là hỗn hợp 2 dung môi hexan : ethyl acetat (20 : 1→5 : 1). Hứng dịch rửa giải vào bình nón 50 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu đƣợc 3 phân đoạn: PĐ3-1 (0,94 g); PĐ3-2 (1,01 g); PĐ3-3 (1,54 g); PĐ3-4 (1,04 g).
+ Phân đoạn PĐ3-2 (1,01 g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 2 cm x 60 cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt (0,040- 0,063 mm, Merck), dung