Sau khi nuôi tăng sinh khối cùng với thực hiện ly trích và nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học, tất cả các dòng nấm đƣợc khảo sát – 5 dòng đã phân lập và 2 dòng R. oryzae, A. niger – đều có khả năng sản xuất đƣợc chitosan.
Hình 11. Chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae đƣợc nhận diện bằng phƣơng pháp hóa học
(1: Sau khi nhỏ dung dịch I2/KI; 2: Sau khi nhỏ dung dịch H2SO4 1% ở bước tiếp theo)
Tất cả các dòng nấm mốc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều phát triển tốt trong môi trƣờng PDB. Sau 10 ngày nuôi cấy, dòng nấm R. oryzae có sinh khối trung bình của 3 lần lặp lại thấp nhất (0,43g), kế đó là dòng nấm ST2.2 với sinh khối trung bình là 0,88g. Trong khi đó, dòng nấm có sinh khối trung bình cao nhất là ST3 với trung bình sinh khối của 3 lần lặp lại là 1,25g. Các dòng nấm còn lại có sinh khối trung bình tƣơng đƣơng nhau, dao động từ 0,94g (ở dòng nấm ST2.1) đến 1,06g (ở dòng nấm A. niger).
Tuy sinh khối của dòng nấm R. oryzae thấp nhất nhƣng lại có lƣợng chitosan trích đƣợc cao vƣợt trội so với lƣợng chitosan trích đƣợc từ các dòng khác (31,0mg). 2 dòng nấm có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc cao thứ 2 và thứ 3 lần lƣợt là ST2.1 (8,4mg) và ST2.2 (7,9mg). Các dòng nấm còn lại có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc khá ít so với 3 dòng đã nêu trên, dao động từ 3,7mg (ở dòng TV1) đến 4,2mg (ở dòng A. niger). Đặc biệt 2 dòng ST3 và BL1 có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc bằng nhau và đều bằng 4,1mg.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 8. Trung bình sinh khối và trung bình chitosan trích đƣợc giữa 3 lần lặp lại của các dòng nấm
Dòng nấm Sinh khối trung bình (g) Chitosan trung bình (mg)
ST2.1 0,94 8,4 ST2.2 0,88 7,9 ST3 1,25 4,1 BL1 1,00 4,1 TV1 1,02 3,7 Rhizopus oryzae 0,43 31,0 Aspergillus niger 1,06 4,2
Qua so sánh tƣơng quan giữa sinh khối của các dòng nấm và lƣợng chitosan trích đƣợc có thể thấy đƣợc lƣợng chitosan trích đƣợc không tỷ lệ thuận với sinh khối. Để so sánh xem ở cùng 1 sinh khối thì lƣợng chitosan trích đƣợc giữa các dòng nấm khác biệt nhau nhƣ thế nào, lƣợng chitosan trích đƣợc ở từng lần lặp lại của tất cả các dòng nấm đƣợc quy về lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối và dùng phần mềm thống kê Minitab để so sánh sự khác biệt. Sau 10 ngày nuôi trong môi trƣờng PDB để tăng sinh khối, trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của dòng R. oryzae là cao nhất (đạt 71,7 mg g-1, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95% so với trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của các dòng nấm còn lại). Bên cạnh đó, trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của 2 dòng nấm ST2.1 (9,0 mg g-1) và ST2.2 (9,1 mg g-1) không chênh lệch nhau nhiều, khác biệt giữa chúng không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Khác biệt giữa trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của các dòng nấm mốc còn lại: ST3(3,3 mg g-1), TV1(3,7 mg g-1),
A. niger (3,9 mg g-1) và BL1 (4,1 mg g-1) không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Theo báo cáo của Pochanavanich and Suntornsuk (2002), hàm lƣợng chitosan đƣợc sản xuất cao nhất từ chủng nấm Rhizopus oryzae TISTR3189 (138mg/g). Trƣớc đó, Nadarajah et al., (2001) đã ly trích chitosan từ chủng Rhizopus oryzae 0602 với hàm lƣợng 56mg/g và chitosan của chủng Rhizopus oligosporus là 30mg/g. Trong nghiên cứu này mặc dù hàm lƣợng chitosan thu đƣợc từ Rhizopus oryzae là cao nhất so với các dòng nấm mốc khác nhƣng so sánh với các nghiên cứu trƣớc đó khi quy đổi về cùng thời gian nuôi cấy thì lƣợng chitosan ở mức chƣa cao, có thể là do nuôi cấy trong điều kiện chƣa thích hợp nên sinh khối không tăng nhiều.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 9. Lƣợng chitosan/1g sinh khối nấm thu đƣợc từ các dòng nấm
Dòng nấm Lƣợng Chitosan/1g sinh khối nấm (mg g-1 ) Aspergillus Niger 3,9 c BL1 4,1 c Rhizopus Oryzae 71,7 a ST2.1 9,0 b ST2.2 9,1 b ST3 3,3 c TV1 3,7 c P-value 0,000 F 2439,70 CV (%) 10,72
(Ghi chú: Các giá trị trung bình có chữ cái phía sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 95% (P<0,05))
Hình 12. Hàm lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của các dòng nấm 4.3. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli của chitosan
*Kết quả khảo sát trên môi trƣờng đặc với dung môi acid acetic 5%
Sau 24 giờ, tất cả các mẫu giấy đƣợc tẩm dung dịch chitosan của các dòng nấm và dung dịch chitosan đối chứng đều có vòng sáng kháng khuẩn đĩa môi trƣờng LB- agar. Tuy nhiên, mẫu giấy đƣợc tẩm dung dịch acid acetic đối chứng cũng có vòng sáng kháng khuẩn. Từ đó cho thấy vòng sáng kháng khuẩn quanh các mẫu giấy đƣợc tẩm chitosan có thể là do tác dụng của dung môi acid acetic tạo nên và thí nghiệm này chƣa thể khảo sát đƣợc khả năng kháng E. coli của chitosan trích đƣợc.
Việc sử dụng acid acetic 5% làm dung môi hòa tan chitosan là không phù hợp vì nồng độ 5% là khá cao. Trong báo cáo của Liu et al. (2005) đã chỉ ra rằng acid acetic
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
có hoạt tính kháng khuẩn. Vì thế nên sử dụng acid acetic với một nồng độ thấp hơn mà tại đó, acid acetic không có khả năng kháng khuẩn.
Hình 13. Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chitosan trích đƣợc từ 2 dòng nấm R. oryzae và ST2.2
(ĐC1, ĐC2, ĐC3: 3 mẫu đối chứng lần lượt là nước cất, acid acetic 5% và chitosan công nghiệp)
*Đánh giá nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan trích từ nấm R. oryzae
Kết quả cho thấy (Bảng 10) ở nghiệm thức 2, chỉ số OD đo đƣợc là 1,510 trong khi ở nghiệm thức 4, chỉ số OD đo đƣợc là 1,532. Từ đó cho thấy acid acetic nồng độ 1% không ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của E. coli. Ở nghiệm thức 6, khi sử dụng chitosan với nồng độ 300mg/L, trung bình chỉ số OD của 3 lần lặp lại là 0,746. Ở các nồng độ cao hơn: 500mg/L và 700mg/L, kết quả trung bình chỉ số OD của 3 lần lặp lại đều bằng 0,000. Từ kết quả này có thể thấy rằng, tại nồng độ 300mg/L chỉ ức chế khoảng 50% sự tăng trƣởng của vi khuẩn chứ chƣa ức chế hoàn toàn. Kể từ nồng độ 500mg/L, chitosan trích từ R. oryzae có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của E. coli. Nhƣ vậy nồng độ tối thiểu có thể sử dụng của chitosan trong diệt khuẩn là: 300mg/L< chitosan ≤ 500mg/L.
Theo Jeihanipour et al. (2007) cho biết chitosan của nấm R. oryzae ở mức 200mg/L chỉ có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli và Staphylococcus aureus
ở mức 60% và với nồng độ 500mg/L chitosan ức chế hoàn toàn vi khuẩn E. coli nhƣng với vi khuẩn Staphylococcus aureus là 700mg/L. Ngoài ra cũng theo nghiên cứu của tác giả này đã cho thấy dung dich acid acetic 1% nếu dử dụng trong khoảng dƣới 1000ppm (tức là tƣơng đƣơng 1ml/L môi trƣờng) thì hoàn toàn không ảnh hƣởng đến
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
tăng trƣởng ủa vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, lƣợng tối đa của acetic acid 1% đã đƣợc dử dụng là 700ppm (và nồng độ này cũng đã không ảnh hƣởng đến tăng trƣởng của vi khuẩn.
Bảng 10. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng lỏng
Nghiệm thức Trung bình chỉ số OD610nm
2 1,510
4 1,532
6 0,746
8 0,000
10 0,000
Hình 14. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trích từ R. oryzae ở các nồng độ khác nhau thông qua chỉ số OD610nm
*Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan trích từ R. oryzae trên môi trƣờng đặc
Sau khi khảo sát khả năng kháng E. coli của chitosan trích đƣợc trên môi trƣờng lỏng và chứng minh đƣợc rằng acid acetic nồng độ 1% (v/v) không có ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của E. coli, thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trích từ nấm R. oryzae đƣợc hiện trên môi trƣờng đặc. Dung dịch chitosan đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này có nồng độ 1% (w/v) với dung môi là acid acetic 1%.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Sau 16 giờ nuôi cấy, kết quả từ hình 15 đã cho thấy mẫu giấy đối chứng (đƣợc tẩm 100µL acid acetic 1%) không có dấu hiệu ức chế E. coli trong khi các mẫu giấy lọc đƣợc tẩm 50µL dung dịch chitosan 1% (w/v) có vòng kháng khuẩn xung quanh, với độ rộng trung bình của các vòng kháng khuẩn là 2mm. Ở các mẫu giấy đƣợc tẩm 100µL chitosan 1% (w/v), các vòng kháng khuẩn rộng hơn, với độ rộng trung bình là 3mm. Nhƣ vậy, dung dịch chitosan 1% đƣợc pha từ chitosan trích từ nấm R. oryzae
với dung môi acid acetic 1% đã cho thấy hiệu quả kháng E. coli trên môi trƣờng đặc (LB-agar) mà không bị tác dụng của dung môi làm ảnh hƣởng đến quá trình kiểm tra hoạt tính.
Bảng 11. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch chitosan với dung môi acid acetic 1%
Nghiệm thức từ rìa mẫu giấu lọc (mm) sau 24 giờ Bán kính vòng kháng khuẩn tính Đối chứng 100µL acid acetic 1% 0
50µL dung dịch chitosan 1% 2mm
100µL dung dịch chitosan 1% 3mm
Hình 15. Vòng kháng khuẩn xuất hiện quanh các mẫu giấy đƣợc tẩm dung dịch chitosan 1% trong dung môi acid acetic 1%
(1: các mẫu giấy được 50µL dung dịch chitosan; 2: các mẫu giấy được 100µL dung dịch chitosan; 3: đối chứng)
4.4. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của chitosan
Nấm C. gloeosporioides ở mẫu đối chứng đã phát triển tốt chứng tỏ khả năng sinh trƣởng của loài nấm này trên môi trƣờng PDA tinh khiết. Ở các thí nghiệm có đặt các mẫu giấy tẩm 100µL và 150µL chitosan 1% (w/v), C. gloeosporioides không thể
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
lan đến nơi có chitosan. Điều đó chứng tỏ khả năng kháng nấm của chitosan trên bề mặt môi trƣờng PDA.
Hình 16. Nấm C. gloeosporioides phát triển tốt trên môi trƣờng PDA không có chitosan
Nghiên cứu của Ali et al. (2012) đã thành công trong việc dùng dung dịch chitosan 1,5% để kháng hoàn toàn C. gloeosporioides trên trái đu đủ bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan 1,5% trong 5 giây. Tuy nhiên trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của chitosan, chỉ cần dùng nồng độ 1% đã có thể ngăn cản đƣợc sự lan ra của C. gloeosporioides trên môi trƣờng PDA. Nguyên nhân có thể là do trong nghiên cứu đƣợc thực hiện trƣớc đó, chitosan chỉ đƣợc phủ trên bề mặt quả đu đủ còn trong thí nghiệm in vitro này, chitosan 1% (w/v) đƣợc tẩm vào tập trung vào 1 vị trí nhất định với thể tích lớn nên vẫn có thể ức chế đƣợc sự lan ra của nấm bệnh đến những nơi có tẩm chitosan.
Hình 17. Khả năng kháng nấm của chitosan 1% trích từ nấm với các thể tích 100µL (phải) và 150µL (trái)
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
4.5. Ứng dụng chitosan trong nuôi cấy mô
Một trong những vấn đề nan giải nhất của nuôi cấy mô là mẫu nuôi cấy bị nhiễm khuẩn và nhiễm nấm mốc, đặc biệt là nhiễm khuẩn nội sinh thì không có cách nào để khắc phục vì nếu thêm kháng sinh vào môi trƣờng nuôi cấy để diệt khuẩn hay nấm mốc thí dụ nhƣ dùng ampicillin hay streptomycin..v..v thì mô thực vật không thể phát triển đƣợc vì hầu hết các chất kháng sinh này đã ức chế sự phát triển của mô.
Hình 18. Các mẫu đinh lăng nuôi cấy mô bị nhiễm khuẩn (A) và nấm mốc (B)
Trong nghiên cứu này chitosan với nồng độ 400mg/L đã đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy mô cây đinh lăng. Kết quả từ hình 18 đã cho thấy chồi đinh lăng đã bị nhiễm khuẩn (Hình A) và chồi đinh lăng đã bị nhiễm nấm mốc trƣớc đó (Hình B) đã đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới có bổ sung chitosan, sau 7 ngày nuôi cấy đã hạn chế đƣợc sự phát triển của nấm mốc (Hình 19A) và ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn (Hình 19B), trong khi mẫu đinh lăng đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới không bổ sung chitosan đã xuất hiện nấm mốc trở lại rất nhiều. Kết quả này giúp giải quyết đƣợc vấn đề khó khăn trong ngăn chặn những mô nuôi cấy in vitro có nguy cơ bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm và cứu lấy những mô cấy quý hiếm đã bị nhiễm khuẩn và nấm mốc.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 19. Chồi đinh lăng giảm bớt nhiễm nấm mốc (A) và không còn nhiễm khuẩn (B) trên môi trƣờng nuôi cấy có chứa chitosan 400mg/L. Hình C: Mẫu đinh lăng bị nhiễm nấm mốc trở lại trên môi trƣờng không có bổ sung chitosan
Trong nhân giống in vitro, chitosan đã đƣợc sử dụng và có hiệu quả cải thiện chất lƣợng cây con, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho sự thuần dƣỡng cây con ở điều kiện ex vitro (Nge et al., 2006). Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trƣởng và phát triển của lan Dendrobium dƣới dạng phun lên cây trồng bên ngoài cũng nhƣ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro đã đƣợc báo cáo (Chandrkrachang, 2002; Limpanavech et al., 2003, Nge et al., 2006). Gần đây, nghiên cứu của Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Toàn (2012) cũng đã cho thấy bổ sung chitosan 5-25 mg/L có hiệu quả cho sự sinh trƣởng của cụm chồi với số chồi, chiều cao chồi gia tăng tƣơng đối và tỷ lệ tạo rễ đều đạt các giá trị cao. Đối với nuôi cấy cây lan con, nồng độ chitosan 15 mg/L và 25 mg/L cải thiện đáng kể chiều cao và sự hình thành rễ mới của cây con ở 70 ngày sau khi cấy. Từ đó cho thấy việc sử dụng chitosan trong nuôi cấy mô có thể diệt khuẩn và nấm mốc nhƣng hoàn toàn không gây hại cho sự phát triển của mô.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận
Đề tài đã phân lập đƣợc 5 dòng nấm mốc có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có chitin là nguồn carbon duy nhất.
Cả 5 dòng nấm đƣợc phân lập cùng với 2 dòng nấm R. oryzae và A. niger đều có khả năng sản xuất ra đƣợc chitosan qua quá trình ly trích trực tiếp từ sinh khối. Trong đó lƣợng chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae là cao nhất mặc dù sinh khối của dòng nấm này sau 10 ngày nuôi tăng sinh khối là thấp nhất.
Chitosan trích từ nấm R. oryzae đã cho thấy khả năng kháng vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng LB ở nồng độ 500mg/L và trên môi trƣờng LB-agar ở nồng độ 1% (w/v); và khả năng nấm C. gloeosporioides trên môi trƣờng PBA ở nồng độ 1% (w/v).
Chitosan đƣợc ứng dụng thành công trong nuôi cấy mô để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc gây hại cho mô nuôi cấy.
5.2. Kiến nghị
Khảo sát khả năng kháng nấm và kháng khuẩn của chitosan từ nấm trên các loại nấm và vi khuẩn gây bệnh khác.
Sử dụng môi trƣờng chuyên biệt dành cho R. oryzae để tăng sinh khối, từ đó có thể tăng lƣợng chitosan trích đƣợc.
Phân lập thêm các dòng nấm mốc có khả năng phân giải lớp vỏ chitin dày của các loại côn trùng cánh cứng.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Giáo trình thực tập môn Vi sinh vật đại cương, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Toàn. 2012. Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trƣởng của cụm chồi và cây con lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro. Tạp chí khoa học 2012, 24a:88-95.
Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết. 2006. Thí nghiệm công nghệ sinh học (2): Thí nghiệm vi sinh vật học. Nxb. Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
Ali A., M. T. M. Mohamed and Y. Siddiqui. 2012. Control of anthracnose by chitosan through stimulation of defence-related enzymes in Eksotika II Papaya (Carica papaya L.) fruit. Journal of Biology and Life Science, 3(1):114-126.
Chandrkrachang S. 2002. The applications of chitin in agriculture in Thailand.
Advances in Chitin Science, 5:458-462.
Ghosh, B. and R. R. Ray. 2011. Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: A review. Journal of Applied Sciences, 11(14):2470-2486l.