Nuôi tăng sinh khối các dòng nấm trong 150mL môi trƣờng PDB trong 10 ngày. Trích chitosan theo quy trình của Pochanavanich và Suntornsuk (2002), có thay đổi một số bƣớc cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm):
- Thu sinh khối nấm, rửa sạch bằng nƣớc cất và sấy khô ở 65oC.
- Nghiền mịn mẫu nấm. Trộn với dung dịch NaOH 1M (1:30 w/v) và khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Chia nhỏ mẫu vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa.
- Rửa kết tủa với nƣớc cất. Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL và ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa.
- Cho kết tủa vào dung dịch acid acetic 2% (1:40 w/v), ủ ở 95oC trong 8 giờ. - Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần dịch lỏng.
- Điều chỉnh về pH 10 bằng dung dịch NaOH.
- Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa (chitosan).
- Rửa chitosan thu đƣợc bằng nƣớc cất. Cân khối lƣợng một ống eppendorf. Gom lƣợng chitosan lại trong ống eppendorf trên và ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ phần dịch lỏng, giữ lại phần kết tủa.
- Sấy khô ống eppendorf trên. Cân khối lƣợng sau khi sấy khô và trừ lại khối lƣợng ban đầu của ống để có đƣợc khối lƣợng chitosan thu đƣợc sau khi trích.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 5. Sơ đồ quy trình ly trích chitosan từ nấm mốc 3.3.3. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học
Theo phƣơng pháp của Kaur et al. (2012), sau khi nhỏ dung dịch I2/KI vào chitosan, chitosan chuyển sang màu nâu đậm. Sau đó, khi nhỏ dung dịch H2SO4 1% vào, chitosan chuyển sang màu tím sậm.
Hình 6. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn
Chuyển 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli vào 5mL môi trƣờng LB để nuôi tăng sinh khối trong 16 giờ ở 37oC trên máy lắc với tốc độ 500 vòng/phút.
3.3.5. Chuẩn bị dung dịch chitosan
Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% (w/v) trong dung môi acid acetic 5% (v/v): Hòa tan chitosan thô vào dung dịch acid acetic 5% (v/v) theo tỷ lệ 1 chitosan/100 acid acetic. Ủ trong bể điều nhiệt ở 60oC, lắc đều mỗi 5 phút cho đến khi chitosan tan hoàn toàn.
Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% (w/v) trong dung môi acid acetic 1% (v/v): Hòa tan chitosan thô vào dung dịch acid acetic 1% (v/v) theo tỷ lệ 1 chitosan/100 acid acetic. Ủ trong bể điều nhiệt ở 60oC, lắc đều mỗi 5 phút cho đến khi chitosan tan hoàn toàn.
3.3.6. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan 3.3.6.1. Khảo sát trên môi trƣờng đặc 3.3.6.1. Khảo sát trên môi trƣờng đặc
(Quy trình khảo sát theo Kabir et al. (2011) và Islam et al. (2011), có sửa đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm).
Chuẩn bị dung dịch chitosan: Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% bằng cách hòa tan chitosan trích đƣợc với dung môi là acid acetic 5%. Dùng chitosan đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp hóa học trong công nghiệp để làm đối chứng, chuẩn bị dung dịch chitosan công nghiệp theo cách nhƣ trên.
Dùng micro pipette hút 30µL dung dịch vi khuẩn E. coli đã đƣợc nuôi tăng sinh trong 16 giờ và bơm vào giữa đĩa petri chứa môi trƣờng LB-agar. Dùng que thủy tinh trải đều vi khuẩn ra đĩa.
Đặt những mẫu giấy lọc hình tròn, đƣờng kính 0,6cm – 1,5cm lên bề mặt đĩa. Đặt giấy lọc cách đều nhau.
Dùng micro pipette hút dung dịch chitosan dung dịch của các mẫu đối chứng, bơm vào từng mẫu giấy lọc.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 7. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng đặc
3.3.6.2. Khảo sát trên môi trƣờng lỏng
Chuẩn bị dung dịch chitosan với nồng độ 1% (w/v) trong dung dịch acid acetic 1% (v/v).
Nuôi tăng sinh khối vi khuẩn E. coli trong 5mL môi trƣờng LB, ủ trên máy lắc với tốc độ 500 vòng/phút trong 16 giờ ở 37oC. Chủng 10µL dung dịch vi khuẩn E. coli
vào ống falcon chứa 5mL môi trƣờng LB.
Thêm dung dịch chitosan 1% (w/v) với các thể tích khác nhau vào ống falcon trên. Ủ trên máy lắc 16h ở 37oC. Đo OD ở bƣớc sóng 610nm.
3.3.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan
(Quy trình khảo sát đƣợc thiết kế theo Kabir et al. (2011) và Islam et al. (2011), có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm).
Đặt những mẫu giấy lọc vô trùng hình tròn, đƣờng kính 1,5cm lên bề mặt đĩa petri chứa môi trƣờng PDA. Đặt giấy lọc cách đều nhau.
Dùng micro pipette hút dung dịch chitosan 1% và tẩm vào các mẫu giấy lọc. Cấy nấm Colletotrichum gloeosporioides vào giữa đĩa petri trên. Quan sát và ghi nhận sự phát triển của nấm.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 8. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan 3.3.8. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm minitab 16.
3.4. Bố trí thí nghiệm
3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc *Mục đích *Mục đích
Phân lập và tuyển chọn những dòng nấm có khả năng phân giải và sử dụng chitin nhƣ nguồn carbon để sinh trƣởng và phát triển.
Khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn ty và bào tử của các dòng nấm phân lập đƣợc.
*Bố trí thí nghiệm
Bảng 2. Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc Đặc điểm hình thái Dòng nấm 1 Dòng nấm 2 Dòng nấm 3 Khuẩn ty Màu sắc Vách ngăn Phân nhánh Cuống bào tử đính Màu sắc bào tử Hình dạng bào tử
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
*Mục đích
So sánh khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm mốc.
*Bố trí thí nghiệm
Nuôi tăng sinh khối các dòng nấm mốc và trích chitosan theo quy trình đã nêu ở mục 3.3.2.
Nhận diện chitosan trích đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học đã nêu ở mục 2.2.6. Phân tích thống kê số liệu ghi nhận đƣợc.
Bảng 3. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng sản xuất chitosan giữa các dòng nấm
Nghiệm thức Lặp lại Lƣợng chitosan thu đƣợc (mg/1g sinh khối)
Dòng nấm 1 3
Dòng nấm 2 3
Dòng nấm 3 3
3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan *Mục đích *Mục đích
Khảo sát và so sánh khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli với các loại dung dịch chitosan khác nhau.
Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chitosan trích đƣợc từ dòng nấm có hiệu quả sản xuất chitosan cao nhất trong các dòng nấm đƣợc khảo sát, trên môi trƣờng lỏng và môi trƣờng đặc ở các nồng độ khác nhau.
3.4.3.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dung dịch chitosan trích đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc
*Bố trí thí nghiệm
Nhỏ 10µL dung dịch chitosan 1% (trong dung môi acid acetic 5%) đƣợc trích từ các dòng nấm lên các mẫu giấy nhƣ đã mô tả ở mục 3.3.6.1 và hình 7. Tƣơng tự nhỏ 10µL các dung dịch đối chứng: chitosan công nghiệp 1% (trong dung môi acid acetic 5%), nƣớc cất và acid acetic 5% lên các mẫu giấy còn lại trên đĩa petri. Dùng giấy parafilm quấn quanh đĩa petri và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Khảo sát vòng kháng khuẩn.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trong dung môi acid acetic 5% trên môi trƣờng đặc
Số thứ tự Nghiệm thức Lặp lại
1 Đối chứng nƣớc cất 1 x 2 dĩa
2 Đối chứng acid acetic 5% 1 x 2 dĩa
3 Đối chứng chitosan công nghiệp 1 x 2 dĩa
4 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 1 3 x 2 dĩa
5 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 2 3 x 2 dĩa
6 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 3 3 x 2 dĩa
3.4.3.2. Khảo sát nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan *Bố trí thí nghiệm *Bố trí thí nghiệm
Trong thí nghiệm này chỉ sử dụng một loại chitosan đƣợc trích từ dòng nấm nào có tiềm năng để sản xuất chitosan với năng suất cao nhất. Tiến hành nuôi tăng sinh khối dòng nấm này trong 2L môi trƣờng nhằm thu đƣợc hàm lƣợng cao chitosan đủ phục vụ cho nghiên cứu này và các nghiên cứu tiếp theo. Chitosan sau khi đƣợc ly trích xong đƣợc pha loãng vào dung dich acid acetic 1% với nồng độ chitosan 1% (w/v). Từ dung dịch này, chuyển chitosan với các nồng độ 300mg/L, 500mg/L và 700mg/L vào môi trƣờng nuôi cấy để đánh giá nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 5. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng lỏng
Số thứ tự Nghiệm thức Chỉ tiêu đánh giá OD610nm
1 5mL LB Mẫu blank để đo OD cho nghiệm
thức 2
2 5mL LB + 30µL dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
3 5mL LB + 350µL acid acetic 1% Mẫu blank để đo OD cho nghiệm
thức 4
4 5mL LB + 350µL acid acetic 1%
+ 30µL dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
5 5mL LB + 150µL chitosan (tƣơng
đƣơng 300mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 6
6 5mL LB + 150µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
7 5mL LB + 250µL chitosan
(tƣơng đƣơng 500mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 8
8 5mL LB + 250µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
9 5mL LB + 350µL chitosan (tƣơng
đƣơng 700mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 10
10 5mL LB + 350µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan *Mục đích *Mục đích
Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ trên thực vật của loại chitosan trích từ dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan cao nhất.
*Bố trí thí nghiệm
Bảng 6. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan
Nghiệm thức Lặp lại Bán kính vòng kháng nấm tính từ rìa mẫu giấu lọc (mm)
Đối chứng 1
100µL dung dịch chitosan 1% 3
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc 4.1.1. Kết quả quá trình phân lập 4.1.1. Kết quả quá trình phân lập
Sau khi trải các mẫu đất thu từ các tỉnh Kiên Giang, Bạc Liêu, Trà Vinh, Sóc Trăng và Cà Mau trên môi trƣờng phân lập, có 5 dòng nấm mốc đã đƣợc tuyển chọn và phân lập. Trong số đó có 3 dòng phân lập từ mẫu đất ở Sóc Trăng, đƣợc đặt tên là ST2.1, ST2.2, ST3; 1 dòng phân lập từ mẫu đất ở Trà Vinh, đƣợc đặt tên là TV1 và 1 dòng phân lập từ mẫu đất ở Bạc Liêu, đƣợc đặt tên là BL1. Các dòng nấm trên đều cho thấy khả năng phân giải chitin. Trong đó có 2 dòng cho thấy khả năng phân giải chitin cao khi có vòng sáng hình thành xung quanh khuẩn lạc của chúng. 3 dòng nấm còn lại tuy không tạo đƣợc vòng sáng nhƣng cũng phát triển tốt trên môi trƣờng có chitin là nguồn carbon, khi quan sát từ bên dƣới đĩa môi trƣờng, có thể thấy đƣợc một lƣợng chitin nơi khuẩn lạc của chúng phát triển đã bị phân giải và tiêu biến đi.
Hình 9. Vòng sáng xuất hiện quanh 1 khuẩn lạc của dòng nấm ST3 (phải) và TV1 (trái) sau 5 ngày nuôi cấy trong môi trƣờng chitin
4.1.2. Khảo sát đặc điểm của các dòng nấm mốc đã phân lập
Tất cả 5 dòng nấm đã phân lập đƣợc đều phát triển tốt trên môi trƣờng chitin, cho thấy khả năng phân giải chitin thành các chất hữu cơ cần thiết của các dòng nấm này.
Khi quan sát bằng mắt thƣờng, hình dạng khuẩn lạc của 5 dòng nấm khá tƣơng đồng. Các khuẩn lạc khi chƣa sinh bào tử có màu trắng.
Khi quan sát dƣới kính hiển vi, khuẩn ty của tất cả các dòng nấm mốc đã phân lập đều vách ngăn và phân nhánh. Trong đó dòng ST3 và ST2.2 có khuẩn ty phân nhánh nhiều, 3 dòng ST2.1, BL1 và TV1 có khuẩn ty dài hơn và ít phân nhánh hơn. Sau thời gian nuôi cấy, tất cả các dòng nấm đều sinh bào tử. Trong 5 dòng nấm thì
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
dòng ST2.2 có cuống bào tử đính không phân nhánh và mang rất nhiều thể bình. Các dòng còn lại đều có cuống bào tử đính phân nhánh nhƣng mang ít thể bình hơn. Ngoại trừ dòng nấm ST3 có bào tử dạng hình bầu dục không đều nhau, các dòng còn lại đều có bào tử hình tròn.
Sau khi dựa vào hình thái để định danh, các dòng nấm đã phân lập đều thuộc chi
Penicillium.
Hình 10. Khuẩn ty và túi bào tử của dòng nấm ST3 (phải) và ST2.2 (trái) quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần
Các chỉ tiêu của mỗi dòng nấm đƣợc ghi nhận sau 7 ngày cấy vào môi trƣờng chitin cũng nhƣ đặc điểm hình thái sợi nấm quan sát đƣợc qua kính hiển vi đƣợc trình bày trong bảng 4.
Bảng 7. Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc
Đặc điểm hình thái ST2.2 BL1 ST3 TV1 ST2.1 Khuẩn ty Màu sắc Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Vách ngăn Có Có Có Có Có Phân nhánh Có Có Có Có Có
Cuống bào tử đính Không phân
nhánh Phân nhánh
Phân
nhánh Phân nhánh
Phân nhánh
Màu sắc bào tử Xanh lá
chuối Xanh lục thẫm Xanh lục đen Xanh ngọc bích Xanh lục thẫm Hình dạng bào tử Tròn Tròn Bầu dục Tròn Tròn Chi Penicillium
Các dòng nấm đã phân lập cùng với 2 dòng nấm Rhizopus oryzae và Aspergillus niger đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
4.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm
Sau khi nuôi tăng sinh khối cùng với thực hiện ly trích và nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học, tất cả các dòng nấm đƣợc khảo sát – 5 dòng đã phân lập và 2 dòng R. oryzae, A. niger – đều có khả năng sản xuất đƣợc chitosan.
Hình 11. Chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae đƣợc nhận diện bằng phƣơng pháp hóa học
(1: Sau khi nhỏ dung dịch I2/KI; 2: Sau khi nhỏ dung dịch H2SO4 1% ở bước tiếp theo)
Tất cả các dòng nấm mốc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều phát triển tốt trong môi trƣờng PDB. Sau 10 ngày nuôi cấy, dòng nấm R. oryzae có sinh khối trung bình của 3 lần lặp lại thấp nhất (0,43g), kế đó là dòng nấm ST2.2 với sinh khối trung bình là 0,88g. Trong khi đó, dòng nấm có sinh khối trung bình cao nhất là ST3 với trung bình sinh khối của 3 lần lặp lại là 1,25g. Các dòng nấm còn lại có sinh khối trung bình tƣơng đƣơng nhau, dao động từ 0,94g (ở dòng nấm ST2.1) đến 1,06g (ở dòng nấm A. niger).
Tuy sinh khối của dòng nấm R. oryzae thấp nhất nhƣng lại có lƣợng chitosan trích đƣợc cao vƣợt trội so với lƣợng chitosan trích đƣợc từ các dòng khác (31,0mg). 2 dòng nấm có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc cao thứ 2 và thứ 3 lần lƣợt là ST2.1 (8,4mg) và ST2.2 (7,9mg). Các dòng nấm còn lại có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc khá ít so với 3 dòng đã nêu trên, dao động từ 3,7mg (ở dòng TV1) đến 4,2mg (ở dòng A. niger). Đặc biệt 2 dòng ST3 và BL1 có trung bình lƣợng chitosan trích đƣợc bằng nhau và đều bằng 4,1mg.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 8. Trung bình sinh khối và trung bình chitosan trích đƣợc giữa 3 lần lặp lại của các dòng nấm
Dòng nấm Sinh khối trung bình (g) Chitosan trung bình (mg)
ST2.1 0,94 8,4 ST2.2 0,88 7,9 ST3 1,25 4,1 BL1 1,00 4,1 TV1 1,02 3,7 Rhizopus oryzae 0,43 31,0 Aspergillus niger 1,06 4,2
Qua so sánh tƣơng quan giữa sinh khối của các dòng nấm và lƣợng chitosan trích đƣợc có thể thấy đƣợc lƣợng chitosan trích đƣợc không tỷ lệ thuận với sinh khối. Để so sánh xem ở cùng 1 sinh khối thì lƣợng chitosan trích đƣợc giữa các dòng nấm khác