3.2.1. Vật liệu
- Mẫu đất thu từ các vùng ven biển thuộc một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Các dòng nấm mốc Aspergillus niger, Rhizopus oryzae và Colletotrichum gloeosporioides cùng với dòng vi khuẩn Escherichia coli do Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học thuộc Đại học Cần Thơ cung cấp.
3.2.2. Dụng cụ
- Ống nghiệm 12ml, falcon 50ml, eppendorf 0,2ml; 1,5ml; 2,0ml - Đĩa petri đƣờng kính 6cm, 10cm; bình tam giác, cốc thuỷ tinh - Kim cấy; que trải mẫu; bộ micropipette; đầu cone xanh, vàng, trắng - Kính mang vật, lame, lamelle, đèn cồn và một số dụng cụ khác…
- Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ, kính hiển vi Olympus (Nhật), máy lắc mẫu, nồi khử trùng nhiệt ƣớt, pH kế Orion 420 A (Hoa Kỳ), cân điện tử Sartorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái Lan), máy ly tâm, máy ly tâm lạnh, tủ ủ 65ºC, bể điều nhiệt Memmert,…
3.2.3. Hóa chất
- Môi trƣờng phân lập (tính trong 1L): 6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, 1g NH4Cl, 0,5g NaCl, 0,05g cao nấm men, 15g agar, chitin huyền phù 1% (w/v); pH 7. Chitin bột và chitin huyền phù đƣợc chuẩn bị từ vỏ tôm:
Bột chitin: Vỏ tôm rửa sạch, sấy khô ở 40oC. Sau đó xử lí tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-75oC trong 4 giờ, rửa sạch bằng nƣớc cất. Tiếp tục tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ, rửa sạch bằng nƣớc cất. Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Chitin huyền phù: thêm từ từ 10g bột chitin vào 200ml HCl đậm đặc (đƣợc làm lạnh trên khay đá), khuấy đều, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thêm vào hỗn hợp 500ml ethanol 95% lạnh, khuấy đều thật nhanh, tiếp tục ủ qua đêm ở 4oC. Ly tâm hỗn hợp ở tốc độ 5000xg (8.000 vòng/phút) trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nƣớc cất cho đến khi nƣớc rửa đạt pH trung tính. Thêm nƣớc cất vào tủa cho đủ 1 lít.
- Môi trƣờng chitin (tính trong 1L): 6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, 1g NH4Cl, 0,5g NaCl, 15g agar, chitin huyền phù 1% (w/v); pH 7.
- Môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar) (tính trong 1L): 200g khoai tây – cắt nhỏ, đun sôi, chắt lấy nƣớc, 20g dextrose, 15g agar; pH 5,6.
- Môi trƣờng PDB (Potato Dextrose Broth) (tính trong 1L): 200g khoai tây – cắt nhỏ, đun sôi, chắt lấy nƣớc, 20g dextrose; pH 5,1.
- Môi trƣờng LB (Luria-Bertani Broth) (tính trong 1L): 10g peptone, 5g cao nấm men, 10g NaCl; pH 7.
- Môi trƣờng LB-agar (tính trong 1L): 10g peptone, 5g cao nấm men, 10g NaCl, 15g agar; pH 7.
- Hóa chất dùng để nhận diện chitosan: Thuốc thử I2/KI.
Dung dịch H2SO4 1% . - Các hóa chất cần thiết khác.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc *Thu thập mẫu đất *Thu thập mẫu đất
Thu lấy mẫu đất ở bờ sông của các nhánh sông gần cửa biển ở một hoặc một số địa phƣơng thuộc các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, mỗi mẫu đất thu khoảng 1 kg:
- Thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang. - Huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng. - Huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu. - Huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
- Huyện Năm Căn, tỉnh Cà Mau. Đất thu về đƣợc trữ trong tủ lạnh.
*Trải mẫu
Cân ngẫu nhiên 10g đất cho vào bình tam giác. Thêm vào 100mL nƣớc cất và khuấy đều trên máy khuấy từ trong 10 phút. Để yên bình tam giác trong 20 phút để đất lắng xuống.
Hút lấy phần chất lỏng trong bình tam giác và pha loãng 101, 102 lần. Cho 100µL các dung dịch đất đã pha loãng vào từng đĩa petri chứa môi trƣờng phân lập (Saima et al., 2013). Dùng que trải thủy tinh để trải đều.
Ủ đĩa petri trong 48 đến 72 giờ ở nhiệt độ phòng.
*Tuyển chọn
Lựa chọn những khuẩn lạc nấm mốc phát triển tốt, có kích thƣớc lớn so với các khuẩn lạc khác. Cấy chuyển những khuẩn lạc trên ra đĩa petri chứa môi trƣờng phân lập. Cấy chuyển nhiều lần cho đến khi nấm mốc trong đĩa trở nên ròng, không phát hiện khuẩn lạc vi khuẩn hoặc sợi nấm lạ.
*Khảo sát đặc điểm
Cấy chuyển những dòng nấm mốc đã phân lập vào môi trƣờng chitin để quan sát hình thái, sự phát triển của khuẩn lạc cũng nhƣ khả năng tạo bào tử. Qua đó so sánh khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng có chitin là nguồn carbon duy nhất giữa các dòng nấm mốc đã phân lập.
Làm tiêu bản của từng dòng nấm bằng phƣơng pháp giọt ép (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) để quan sát trên kính hiển vi để quan sát hình thái của khuẩn ty và bào tử của chúng:
- Nhỏ một giọt nƣớc cất tiệt trùng lên kính mang vật. - Khử trùng kim mũi giáo trên ngọn lửa đèn cồn.
- Chấm đầu kim cấy vào khuẩn lạc nấm mốc, lấy một ít sợi nấm hòa lẩn vào giọt nƣớc trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nƣớc bằng cách cho cạnh kính đật vật nghiêng một góc 45o, rồi hạ từ từ kính đậy vật sao cho đừng có bọt khí trong mẫu.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Dựa vào hình thái để định danh các dòng nấm phân lập đƣợc (Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2006).
3.3.2. Quy trình trích chitosan của các dòng nấm
Nuôi tăng sinh khối các dòng nấm trong 150mL môi trƣờng PDB trong 10 ngày. Trích chitosan theo quy trình của Pochanavanich và Suntornsuk (2002), có thay đổi một số bƣớc cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm):
- Thu sinh khối nấm, rửa sạch bằng nƣớc cất và sấy khô ở 65oC.
- Nghiền mịn mẫu nấm. Trộn với dung dịch NaOH 1M (1:30 w/v) và khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Chia nhỏ mẫu vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa.
- Rửa kết tủa với nƣớc cất. Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL và ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa.
- Cho kết tủa vào dung dịch acid acetic 2% (1:40 w/v), ủ ở 95oC trong 8 giờ. - Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần dịch lỏng.
- Điều chỉnh về pH 10 bằng dung dịch NaOH.
- Chia nhỏ vào các ống eppendorf 2,2mL. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần kết tủa (chitosan).
- Rửa chitosan thu đƣợc bằng nƣớc cất. Cân khối lƣợng một ống eppendorf. Gom lƣợng chitosan lại trong ống eppendorf trên và ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ phần dịch lỏng, giữ lại phần kết tủa.
- Sấy khô ống eppendorf trên. Cân khối lƣợng sau khi sấy khô và trừ lại khối lƣợng ban đầu của ống để có đƣợc khối lƣợng chitosan thu đƣợc sau khi trích.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 5. Sơ đồ quy trình ly trích chitosan từ nấm mốc 3.3.3. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học
Theo phƣơng pháp của Kaur et al. (2012), sau khi nhỏ dung dịch I2/KI vào chitosan, chitosan chuyển sang màu nâu đậm. Sau đó, khi nhỏ dung dịch H2SO4 1% vào, chitosan chuyển sang màu tím sậm.
Hình 6. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn
Chuyển 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli vào 5mL môi trƣờng LB để nuôi tăng sinh khối trong 16 giờ ở 37oC trên máy lắc với tốc độ 500 vòng/phút.
3.3.5. Chuẩn bị dung dịch chitosan
Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% (w/v) trong dung môi acid acetic 5% (v/v): Hòa tan chitosan thô vào dung dịch acid acetic 5% (v/v) theo tỷ lệ 1 chitosan/100 acid acetic. Ủ trong bể điều nhiệt ở 60oC, lắc đều mỗi 5 phút cho đến khi chitosan tan hoàn toàn.
Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% (w/v) trong dung môi acid acetic 1% (v/v): Hòa tan chitosan thô vào dung dịch acid acetic 1% (v/v) theo tỷ lệ 1 chitosan/100 acid acetic. Ủ trong bể điều nhiệt ở 60oC, lắc đều mỗi 5 phút cho đến khi chitosan tan hoàn toàn.
3.3.6. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan 3.3.6.1. Khảo sát trên môi trƣờng đặc 3.3.6.1. Khảo sát trên môi trƣờng đặc
(Quy trình khảo sát theo Kabir et al. (2011) và Islam et al. (2011), có sửa đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm).
Chuẩn bị dung dịch chitosan: Chuẩn bị dung dịch chitosan 1% bằng cách hòa tan chitosan trích đƣợc với dung môi là acid acetic 5%. Dùng chitosan đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp hóa học trong công nghiệp để làm đối chứng, chuẩn bị dung dịch chitosan công nghiệp theo cách nhƣ trên.
Dùng micro pipette hút 30µL dung dịch vi khuẩn E. coli đã đƣợc nuôi tăng sinh trong 16 giờ và bơm vào giữa đĩa petri chứa môi trƣờng LB-agar. Dùng que thủy tinh trải đều vi khuẩn ra đĩa.
Đặt những mẫu giấy lọc hình tròn, đƣờng kính 0,6cm – 1,5cm lên bề mặt đĩa. Đặt giấy lọc cách đều nhau.
Dùng micro pipette hút dung dịch chitosan dung dịch của các mẫu đối chứng, bơm vào từng mẫu giấy lọc.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 7. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng đặc
3.3.6.2. Khảo sát trên môi trƣờng lỏng
Chuẩn bị dung dịch chitosan với nồng độ 1% (w/v) trong dung dịch acid acetic 1% (v/v).
Nuôi tăng sinh khối vi khuẩn E. coli trong 5mL môi trƣờng LB, ủ trên máy lắc với tốc độ 500 vòng/phút trong 16 giờ ở 37oC. Chủng 10µL dung dịch vi khuẩn E. coli
vào ống falcon chứa 5mL môi trƣờng LB.
Thêm dung dịch chitosan 1% (w/v) với các thể tích khác nhau vào ống falcon trên. Ủ trên máy lắc 16h ở 37oC. Đo OD ở bƣớc sóng 610nm.
3.3.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan
(Quy trình khảo sát đƣợc thiết kế theo Kabir et al. (2011) và Islam et al. (2011), có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm).
Đặt những mẫu giấy lọc vô trùng hình tròn, đƣờng kính 1,5cm lên bề mặt đĩa petri chứa môi trƣờng PDA. Đặt giấy lọc cách đều nhau.
Dùng micro pipette hút dung dịch chitosan 1% và tẩm vào các mẫu giấy lọc. Cấy nấm Colletotrichum gloeosporioides vào giữa đĩa petri trên. Quan sát và ghi nhận sự phát triển của nấm.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 8. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan 3.3.8. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm minitab 16.
3.4. Bố trí thí nghiệm
3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc *Mục đích *Mục đích
Phân lập và tuyển chọn những dòng nấm có khả năng phân giải và sử dụng chitin nhƣ nguồn carbon để sinh trƣởng và phát triển.
Khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn ty và bào tử của các dòng nấm phân lập đƣợc.
*Bố trí thí nghiệm
Bảng 2. Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc Đặc điểm hình thái Dòng nấm 1 Dòng nấm 2 Dòng nấm 3 Khuẩn ty Màu sắc Vách ngăn Phân nhánh Cuống bào tử đính Màu sắc bào tử Hình dạng bào tử
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
*Mục đích
So sánh khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm mốc.
*Bố trí thí nghiệm
Nuôi tăng sinh khối các dòng nấm mốc và trích chitosan theo quy trình đã nêu ở mục 3.3.2.
Nhận diện chitosan trích đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học đã nêu ở mục 2.2.6. Phân tích thống kê số liệu ghi nhận đƣợc.
Bảng 3. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng sản xuất chitosan giữa các dòng nấm
Nghiệm thức Lặp lại Lƣợng chitosan thu đƣợc (mg/1g sinh khối)
Dòng nấm 1 3
Dòng nấm 2 3
Dòng nấm 3 3
3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan *Mục đích *Mục đích
Khảo sát và so sánh khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli với các loại dung dịch chitosan khác nhau.
Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chitosan trích đƣợc từ dòng nấm có hiệu quả sản xuất chitosan cao nhất trong các dòng nấm đƣợc khảo sát, trên môi trƣờng lỏng và môi trƣờng đặc ở các nồng độ khác nhau.
3.4.3.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dung dịch chitosan trích đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc
*Bố trí thí nghiệm
Nhỏ 10µL dung dịch chitosan 1% (trong dung môi acid acetic 5%) đƣợc trích từ các dòng nấm lên các mẫu giấy nhƣ đã mô tả ở mục 3.3.6.1 và hình 7. Tƣơng tự nhỏ 10µL các dung dịch đối chứng: chitosan công nghiệp 1% (trong dung môi acid acetic 5%), nƣớc cất và acid acetic 5% lên các mẫu giấy còn lại trên đĩa petri. Dùng giấy parafilm quấn quanh đĩa petri và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Khảo sát vòng kháng khuẩn.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trong dung môi acid acetic 5% trên môi trƣờng đặc
Số thứ tự Nghiệm thức Lặp lại
1 Đối chứng nƣớc cất 1 x 2 dĩa
2 Đối chứng acid acetic 5% 1 x 2 dĩa
3 Đối chứng chitosan công nghiệp 1 x 2 dĩa
4 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 1 3 x 2 dĩa
5 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 2 3 x 2 dĩa
6 Dung dịch chitosan trích từ dòng nấm 3 3 x 2 dĩa
3.4.3.2. Khảo sát nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan *Bố trí thí nghiệm *Bố trí thí nghiệm
Trong thí nghiệm này chỉ sử dụng một loại chitosan đƣợc trích từ dòng nấm nào có tiềm năng để sản xuất chitosan với năng suất cao nhất. Tiến hành nuôi tăng sinh khối dòng nấm này trong 2L môi trƣờng nhằm thu đƣợc hàm lƣợng cao chitosan đủ phục vụ cho nghiên cứu này và các nghiên cứu tiếp theo. Chitosan sau khi đƣợc ly trích xong đƣợc pha loãng vào dung dich acid acetic 1% với nồng độ chitosan 1% (w/v). Từ dung dịch này, chuyển chitosan với các nồng độ 300mg/L, 500mg/L và 700mg/L vào môi trƣờng nuôi cấy để đánh giá nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Bảng 5. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng lỏng
Số thứ tự Nghiệm thức Chỉ tiêu đánh giá OD610nm
1 5mL LB Mẫu blank để đo OD cho nghiệm
thức 2
2 5mL LB + 30µL dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
3 5mL LB + 350µL acid acetic 1% Mẫu blank để đo OD cho nghiệm
thức 4
4 5mL LB + 350µL acid acetic 1%
+ 30µL dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
5 5mL LB + 150µL chitosan (tƣơng
đƣơng 300mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 6
6 5mL LB + 150µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
7 5mL LB + 250µL chitosan
(tƣơng đƣơng 500mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 8
8 5mL LB + 250µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
9 5mL LB + 350µL chitosan (tƣơng
đƣơng 700mg/L)
Mẫu blank để đo OD cho nghiệm thức 10
10 5mL LB + 350µL chitosan + 30µL
dịch vi khuẩn Đo OD ở bƣớc sóng 610nm
3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan *Mục đích *Mục đích
Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ trên thực vật của loại chitosan trích từ dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan cao nhất.
*Bố trí thí nghiệm
Bảng 6. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan
Nghiệm thức Lặp lại Bán kính vòng kháng nấm tính từ rìa mẫu giấu lọc (mm)
Đối chứng 1
100µL dung dịch chitosan 1% 3
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc 4.1.1. Kết quả quá trình phân lập 4.1.1. Kết quả quá trình phân lập
Sau khi trải các mẫu đất thu từ các tỉnh Kiên Giang, Bạc Liêu, Trà Vinh, Sóc