Chủng giống và môi trờng dinh dỡng là tiên đề quan trọng - bảo đảm cho phát trỉên của vi sinh vật và tích luỹ enzim nhng đó chỉ mới là khả năng. Khả năng này trở nên hiện thực còn tuỳ thuộc vào chủ quan của ngời thực hiện - có nắm bắt và đủ khả năng tạo ra những điều kiện tối u cho phát triển của vi sinh vật và tích luỹ enzim hay không. Các điều kiện đó là:
Nhiệt độ:
Nấm men và nấm mốc có nhiệt độ sinh truởng tối u là 280C, vi khuẩn 34 ữ 380C. Trong quá trình sinh trởng và phát triển vi sinh vật đồng hoá chất dinh dỡng và thải ra một lợng nhiệt khá lớn. Do đó trong sản xuất cần phải có những thiết bị để khắc phục hiện tợng tăng nhiệt này. Ví dụ bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào phòng nuôi. Nếu nuôi cấy ở môi trờng lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Độ ẩm môi trờng
Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối u nằm trong giới hạn 65 ữ70% [59], [61] và [62] Trong thực tế sản xuất mức độ vô trùng không thể đạt nh trong phòng thí nghiệm nên ngời ta thờng nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Tuỳ điều kiện mỗi nớc và ở từng nhà máy độ ẩm có thể trong khoảng 60 ữ 50%. ở các nớc tiên tiến độ ẩm của môi trờng là 58 ữ 60%, ở nớc ta các nhà máy rợu khống chế ở 50%. Độ ẩm môi trờng thấp hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn những vi sinh vật phát triển chậm và tích luỹ enzim ít, do đó phải kéo dài thời gian nuôi cấy. Trong quá trình phát triển canh trờng bị nóng và làm giảm độ ẩm do toả nhiệt. Vì thế cần quạt không khí ẩm vào phòng nuôi và tìm cách duy trì nhiệt độ vào khoảng 28 ữ 320C và hạn chế mức giảm nhiệt độ của canh trờng. Muốn vậy không khí đi vào phòng nên có nhiệt độ 26 ữ 280C và độ ẩm tơng đối 95 ữ 98%. Các cơ sở sản xuất chế phẩm enzim ở Việt Nam cha chú ý đến vấn đề
này. Đây chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến hoạt lực thấp của chế phẩm.
pH môi trờng
Khi nuôi cấy trên môi trờng rắn theo phơng pháp bề mặt thì pH ít ảnh hởng tới sinh trởng và phát triển của nấm mốc. Thờng áp dụng pH của môi trờng tự nhiên vào khoảng 5,5 ữ 6 thì hạn chế đợc tạp khuẩn nhng ảnh hởng xấu đến tích tụ enzim. Khi nuôi cấy trong môi trờng lỏng pH ban đầu thờng cao hơn vào khoảng 6 ữ 7. Đối với A. oryzae sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 ữ 6,0. Ngợc lại khi nuôi cấy A.
awamori để nhận glucoamylaza sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 ữ 7,8 [43].
Thực tế pH có những ảnh hởng tới tích tụ enzim vì thế trong sản xuất thờng sử dụng axit hoặc amoniăc để điều chỉnh pH, giữ cho pH luôn trong khoảng tối u [43].
Điều kiện cung cấp oxy
Oxy rất cần cho quá trình phát triển và tích tụ enzim. Trong sản xuất rợu bia, tuy là quá trình lên men nhng giai đoạn đầu nấm men vẫn cần oxy để sinh trởng tới mức cần thiết.
Khi nuôi cấy theo phơng pháp bề mặt nấm men và nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy không khí do sợi nấm và hệ sợi; nhờ đó nhận đợc oxy từ không khí. Vì thế môi trờng nuôi cấy phải xốp, lúc cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ enzim. Nếu môi trờng sính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra lên men, ảnh hởng xấu tới tổng hợp enzim [47].
Giai đoạn đầu của sự phát triển nấm mốc cha cần nhiều năng lợng. Bào tử bắt đầu hút ẩm để phát triển, nhiệt toả ra cha nhiều. Do đó lợng không khí quạt vào phòng chỉ chiếm 4 ữ 5 lần thể tích phòng nuôi. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ữ 12 giờ và cũng phụ thuộc vào chủng giống, độ ẩm và tỷ lệ giống trộn vào [12].
Giai đoạn 2 nấm mốc phát triển mạnh, toả nhiều nhiệt cần cung cấp oxy và thải nhiệt để canh trởng đỡ bị nóng và khô. Lợng không khí cần cung cấp trong 1 giờ khoảng 30 ữ 60 lần thể tích phòng nuôi. Lợng oxy thực tế cần cho giai đoạn này chỉ khoảng 8m3/tấn canh trờng/giờ (tơng đơng 40m3 không khí) nhng vì vi sinh vật chỉ có khả năng kịp sử dụng 6 ữ 7% oxy trong không khí. Mặt khác cần giảm nhiệt độ canh trờng nên yêu cầu lợng không khí cần cấp cho 1 tấn canh trờng ở giai đoạn phát triển mạnh nhất là 600 m3/h. Nếu tính cả lợng không khí cần cho thải nhiệt thì phải lên tới 3000m3/tấn giờ hoặc hơn nữa [63].
Giai đoạn 3 kéo dài 8 ữ 12 giờ cuối, cờng độ hô hấp và toả nhiệt giảm, lợng không khí chỉ cần 4 ữ 5 lần thể tích phòng nuôi [60].
Sự tích tụ enzim phụ thuộc vào chủng giống vi sinh vật và loại enzim. Ví dụ:
A. oryzae tích tụ nhiều enzim khác nhau amylaza đợc tích tụ nhiều nhất sau 21 ữ 30 giờ, còn proteaza tích tụ chậm hơn, thời gian nuôi kéo dài tới 40 ữ 48 giờ. Sự tích tụ hemixenlulaza và xenlulaza kéo dài tới 7 ữ10 ngày. Khi nuôi cấy nấm mốc
Aspergillus trong môi trờng lỏng thời gian kéo dài tới 62ữ72 giờ [40].
Yêu cầu về số lợng không khí và cung cấp oxy trong môi trờng lỏng cũng có những điểm khác.Vấn đề là phải làm cho oxy của không khí hoà tan vào môi trờng lỏng càng nhiều càng tốt. Khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy của không khí có thể tan vào canh trờng. Lợng oxy hoà tan phải đủ d và chứa 1 ữ 3 mg/ l. Nh vậy mới đủ cho sự phát triển và sinh khối của vi sinh vật; đồng thời phải thừa ra một lợng kể trên. Hiện nay một số nớc nh Nhật Bản, Hà Lan và Đan Mạch đã có nhiều thành công trong việc sục khí. Nhng hớng phát triển hiện nay là không giảm lợng không khí cho 1m3 môi trờng mà ngời ta tăng nồng độ chất dinh dỡng tơng ứng với lợng oxy hoà tan để đạt sinh khối cao và do đó tăng năng suất của thiết bị.
Trên thế giới phơng pháp nuôi cấy chìm trong môi trờng dịch thể đợc xem là phơng pháp tiên tiến và ngày càng đợc hoàn thiện. Quá trình này bao gồm các giai đoạn sau:
1. Nuôi cấy nấm mốc trong điều kiện phòng thí nghiệm.