6. Cấu trúc khóa luận
2.1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo cơ bản
Máy quang phổ Raman đƣợc phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản xuất khác nhau. Nhƣng về cơ bản nó bao gồm 5 bộ phận sau: Nguồn laser, bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detecter, hệ quang.
20
Trong đó:
- Nguồn Laser
Khi sử dụng nguồn laser kích thích, vấn đề quan trọng nhất đƣợc đặt ra đó là nó có gây ra hiện tƣợng huỳnh quang đối với mẫu phân tích hay không. Trong trƣờng hợp khả năng xảy ra huỳnh quang cao thì laser laser hồng ngoại gần (NIR) sẽ là sự lựa chọn thích hợp. Có nhiều loại laser với bƣớc sóng đủ cao để giảm bớt hiện tƣợng huỳnh quang nhƣng nguồn laser hay đƣợc dùng nhất là nguồn laser xung quanh vùng 780nm. Đây là loại laser đƣợc tạo ra dựa trên sự phát quang từ các bán dẫn. Loại nguồn laser này thƣờng đƣợc thiết kế nhỏ gọn, giá thành rẻ và có khả năng kích thích đƣợc cho nhiều mẫu khác nhau. Vì vậy mà loại laser này càng phổ biến trong các máy quang phổ Raman, nhất là trong các máy quang phổ Raman cầm tay. Một loại laser khác đƣợc sử dụng đó là: laser Nd:YAG, nguồn laser này cho bƣớc sóng 1064 nm và thƣờng đƣợc sử dụng trong các máy FT-Raman.
Đối với những mẫu phát huỳnh quang yếu thì ngƣời ta sử dụng các nguồn laser với các bƣớc sóng khoảng 470 - 650 nm. Các nguồn laser này thƣờng dựa trên ion Ar+ và còn có một số loại khác. Tất cả các loại này đều có thể cung cấp một nguồn laser với công suất lớn, dễ xảy ra hiện tƣợng phá hủy mẫu đo.
Các tính năng chính của hai nhóm laser trên đó là: nguồn laser với bƣớc sóng kích thích trong vùng nhìn thấy thƣờng cho tín hiệu tốt hơn, do đó tín hiệu dễ phát hiện hơn bởi vì dòng photon Raman mạnh, nhờ thế mà detector đi cùng với nó thƣờng đơn giản và có thể xảy ra hiện tƣợng huỳnh quang làm che phủ tín hiệu Raman và vì năng lƣợng lớn nên mẫu phân tích dễ bị phá hủy. Các thiết bị sử dụng với nguồn laser kích thích trong vùng nhìn thấy NIR ít nhạy hơn các thiết bị sử dụng với laser trong vùng nhìn thấy. Nhƣng bù lại, tín hiệu đƣờng nên có xu hƣớng thấp hơn, vì vậy việc ghi tín hiệu Raman dễ dàng hơn.
- Thiết bị đựng mẫu
Phƣơng pháp phân tích quang phổ Raman đƣợc xem nhƣ là một phƣơng pháp phân tích nhanh, không cần chuẩn bị mẫu. Nên có thể thu phổ Raman trực tiếp trên bề mặt mẫu qua dầu đo nhanh, đo mẫu bên trong các bao bì lớn thông qua các đầu dò quang học; đo mẫu bằng curvet; đo mẫu rắn, mẫu viên bằng thiết bị giữ mẫu,…
21
Việc lựa chọn các thiết bị lấy mẫu thƣờng đƣợc quyết định bởi bản chất của mẫu phân tích. Tuy nhiên, khi lấy mẫu cần phải cân nhắc khối lƣợng mẫu, tốc độ đo, độ an toàn của nguồn laser, độ tái lặp của phép đo để tối ƣu hóa các thiết bị lấy mẫu nhằm thu đƣợc tín hiệu Raman rõ nhất.
- Quang phổ kế
Cũng nhƣ các loại quang phổ kế khác, quang phổ trong máy Raman có chức năng chính là phân tích ánh sáng dựa theo bƣớc sóng đƣợc thể hiện trên phổ đồ Raman. Có 2 loại quang phổ kế đó là: quang phổ kế phân tán và quang phổ kế không phân tán.
Quang phổ kế phân tán dựa trên sự nhiễu của các bức xạ tán xạ thông qua hệ cách từ. Các quang phổ kế này đƣợc sử dụng cùng với các nguồn laser kích thích từ vùng 400 nm đến 785 nm. Đặc điểm chính của loại quang phổ kế này là rất nhạy tuy nhiên thiết bị này có độ phân giải ở các vùng khác nhau trên phổ đồ không đồng đều. Các loại quang phổ kế này khác phổ biến và đƣợc sử dụng phổ biến mang lại hiệu quả cao. Vấn đề lớn của các quang phổ kế này làm ảnh hƣởng đến hiệu quả của máy quang phổ đó là ánh sáng lạc. Phần lớn bắt nguồn từ ánh sáng laser của nguồn kích thích truyền đến hệ thống quang học. Khi cƣờng độ nguồn mạnh hơn nhiều so với tán xạ Raman thì chúng ta không thể phát hiện đƣợc tín hiệu Raman. Để loại bỏ tín hiệu này ngƣời ta phải sử dụng nhiều hệ thống lọc khác nhau để không cho ánh sáng kích thích truyền đến detector.
Quang phổ kế không phân tán hầu hết đƣợc kết hợp với thiết bị biến điệu FT của tín hiệu và nó cần phân tách số sóng bằng phƣơng pháp vật lí. Các thiết bị này đƣợc sử dụng để định tính các chất hoặc để phát hiện các thay đổi nhỏ trên Raman. Tuy nhiên thiết bị này có độ nhạy tƣơng đối thấp so với phổ kế phân tán.
- Detector
Trong quá trình phát triển công nghệ Raman đã có một số loại detector đƣợc đƣa vào sử dụng nhƣ máy đếm photon, photodiode array, nhƣng detector CCD (Charge Coupled Device) đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong các thiết bị Raman hiện đại. Vì vậy chúng ta sẽ tập trung tìm hiểu về detector CCD.
22
yếu tố cảm quang. Nó tạo ra các quang điện từ, mỗi quang điện từ nhƣ một tải nhỏ để lƣu giữ tín hiệu quang truyền đến. Các tải trên các pixel ở hàng trên cùng đƣợc chuyển từ trái sang phải và đƣợc đọc bởi bộ chuyển đổi từ tín hiệu quang sang tín hiệu số. Để đọc tất cả các tín hiệu trên toàn vùng, hàng trên cùng đƣợc đọc trƣớc bằng cách di chuyển từng vị trí từ trái sang phải, sau khi đọc xong hàng đó, hàng dƣới lại đƣợc chuyển lên trên và quá trình trên đƣợc lặp lại.
Ƣu điểm chính của CCD so với các detector đa kênh khác là độ nhiễu thấp, hiệu suất lƣợng tử cao và độ nhạy trong phạm vi bƣớc sóng rộng.
- Hệ quang
Tùy thuộc vào cách kích thích ánh sáng và cách thu tín hiệu từ mẫu mà hệ quang có các cấu hình 180o, 90o hoặc có thể sử dụng sợi quang để kích thích và thu tín hiệu Raman.
Trong cấu hình 180o các chùm tia laser và chùm ánh sáng tán xạ nằm trên cùng một trụ. Cấu hình này đang đƣợc sử dụng rộng rãi bởi vì không cần thiết phải điều chỉnh thêm chùm laser và bộ phận thu tín hiệu quang. Cấu hình 90o
tạo ra một góc giữa chùm kích thích và chùm tán xạ thu đƣợc. Cấu hình này không có nhiều ý nghĩa thực tế.
Trên thực tế, ngƣời ta thƣờng sử dụng sợi quang đa chế độ, loại sợi này tuy khá cồng kềnh với đƣờng kính từ 50 - 600 µm nhƣng lại rất thuận tiện để kết hợp tia laser với thiết bị thu thập tán xạ. Khi sử dụng thiết bị này, chúng ta đồng thời phải thực hiện hai việc: thu tán xạ Raman và loại bỏ ánh sáng lạc.
Hiện nay cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học công nghệ, các máy quang phổ raman đƣợc phát triển với hiệu lực phân tích cao và đƣợc ứng dụng rộng rãi.
2.1.3. Ứng dụng phổ Raman trong phân tích cấu trúc phân tử
- Ƣu điểm:
+ Không yêu cầu chuẩn bị mẫu nên sẽ tiết kiệm đƣợc thời gian, không cần sử dụng thêm các công cụ hỗ trợ tiết kiệm đƣợc công sức và tiết kiệm kinh phí.
+ Không cần phải xâm lấn vào các cấu tạo bên trong mẫu vì vậy không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong quá trình sản xuất.
23
+ Phƣơng pháp quang phổ Raman có thể phân tích đƣợc chỉ với một lƣợng mẫu nhỏ.
+ Phép phân tích vừa đơn giản, vừa không phải chuẩn bị mẫu và vừa cho kết quả nhanh do đó tiết kiệm đƣợc thời gian phân tích.
+ Việc đào tạo sử dụng đƣợc thiết bị quang phổ raman sẽ rất dễ dàng và áp dụng đƣợc với nhiều đối tƣợng phổ thông khác nhau.
Khi nói đến phổ dao động phân tử, quang phổ raman và phổ hồng ngoại luôn có quan hệ mật thiết với nhau, có tính chất bổ sung cho nhau trong các phép phân tích cấu trúc phân tử. So với quang phổ hồng ngoại thì quang phổ Raman có một số lợi thế hơn nhƣ sau:
+ Đối với các hợp chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí, cho vào ống thủy tinh rồi nút kín thu phổ Raman, trong phổ hồng ngoại thì ống thủy tinh hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
+ Quang phổ Raman có thể dùng định lƣợng chất rắn trong dạng viên, lỏng, và trong dung dịch nƣớc. Phổ hồng ngoại không có đƣợc điều này và nó chủ yếu dùng để định tính.
- Nhƣợc điểm:
+ Kinh phí cho các thiết bị quang phổ Raman cao nên khó có thể sử dụng nhƣ phép phân tích thông thƣờng. Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tƣợng huỳnh quang, sự nóng lên của mẫu đo, sự hấp thụ phổ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh hƣởng của độ phân cực.
2.1.4. Phân tích định tính, định lượng các cấu trúc phân tử
2.1.4.1. Phân tích định tính
Cũng nhƣ quang phổ IR, phổ Raman là phổ dao động phân tử, nó mang thông tin về các nhóm chức của mẫu, vì vậy dựa vào phổ thu đƣợc mà ngƣời ta xác định đƣợc chính xác nhóm chức của chất và từ đó xác định cấu trúc của mẫu. Có các phƣơng pháp định tính hay dùng đó là:
+ Đo phổ Raman, kết hợp với phổ IR để tìm các nhóm chức đặc trƣng, xác định cấu trúc của chất.
24
mặt hay không có mặt của chất phân tích. 2.1.4.2. Phân tích định lượng
Cơ sở để phân tích định lƣợng Raman là cƣờng độ tín hiệu Raman từ mẫu phân tích sẽ tăng tƣơng ứng với sự tăng lên của lƣợng chất cần thăm dò trong mẫu, trong khi các yếu tố khác không thay đổi (cƣờng độ tăng khi nồng độ chất phân tích tăng lên). Về nguyên tắc, điều này đƣợc xác định thông qua tín hiệu tán xạ Raman (trong thí nghiệm) cho bất kỳ thành phần nào của hợp chất và xác định nồng độ thành phần ấy trong mẫu thông qua việc đo tín hiệu Raman của đỉnh đặc trƣng cho thành phần ấy. Thật vậy, ngƣời ta có thể xác định đƣợc nồng độ của mẫu cần đo bằng việc so sánh phổ của chất phân tích với đƣờng cong tƣơng quan đã đƣợc xác định từ trƣớc. Đƣờng cong này đƣợc xây dựng bởi việc đo phổ của mẫu chuẩn với các thành phần đã đƣợc biết đến. Ví dụ nhƣ để định lƣợng các dạng thù hình của Indomethacin, sử dụng tỷ lệ cƣờng độ đỉnh ở 1698 cm-1 (tinh thể) đến 1680 cm-1 (vô định hình) với đƣờng cong tƣơng quan đã đƣợc xây dựng từ trƣớc.
Raman không hề phức tạp hơn các phƣơng pháp thông thƣờng khác, nhƣng có rất nhiều thách thức về kỹ thuật đo cần đƣợc giải quyết. Ví dụ nhƣ cƣờng độ tín hiệu thu đƣợc có thể thay đổi khi chỉ cần một sự thay đổi nhỏ của một trong nhiều thông số của trang thiết bị đang sử dụng (công suất laser, khoảng cách từ vị trí đặt mẫu tới nguồn laser,…), vì vậy các tín hiệu tuyệt đối từ cùng một mẫu đo trên cùng một thiết bị sẽ thay đổi ít nhất một vài phần trăm nếu có một bộ phận nào đó đƣợc lấy ra và thay thế, thậm chí nếu đo mẫu trong cùng một ngày thì tín hiệu đo của buổi sáng và buổi chiều đã có sự khác nhau mặc dù các yếu tố khác không thay đổi. Vì vậy mà khi có vấn đề về sự lặp lại của phép đo thì ngƣời ta rất hiếm khi sử dụng nó trong định lƣợng.
Có hai phƣơng thức tiếp cận để thu đƣợc dữ liệu phổ định lƣợng, đó là phƣơng thức phân tích dữ liệu đơn biến và phân tích dữ liệu đa biến. Trong phƣơng thức thu dữ liệu đơn biến truyền thống, ngƣời ta thƣờng đo cả chiều cao và diện tích peak của vùng dữ liệu đặc trƣng đƣợc quan tâm để so sánh với chiều cao và diện tích peak của chất chuẩn, sau đó tính toán tỉ lệ tƣơng đối của các thành phần để dự đoán và xây dựng cấu trúc của mẫu thử.
25
Hiện tại, phƣơng pháp này vẫn đang đƣợc sử dụng bởi những ƣu điểm không thể phủ nhận của nó đó là phép phân tích đơn giản và cho độ chính xác khá cao. Tuy nhiên,ngày nay phƣơng pháp phân tích dữ liệu đa biến đƣợc sử dụng rộng rãi hơn.
2.2. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp phân tích phổ khối lƣợng 2.2.1. Sự xuất hiện của phổ khối lượng
Phƣơng pháp phổ khối lƣợng có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Dựa trên các số khối thu đƣợc trên phổ có thể xây dựng cấu trúc phân tử hoặc chứng minh sự đúng đắn của công thức cấu tạo dự kiến.
Phƣơng pháp phổ khối là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lƣợng trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế.
Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phƣơng pháp phổ khối, cho ra phổ khối lƣợng của một mẫu để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lƣợng khác nhau và lƣu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cƣờng độ dòng ion. Một khối phổ kế thông thƣờng gồm 3 phần: phần nguồn ion, phần phân tích khối lƣợng, và phần đo đạc.
2.2.2. Quá trình ion hóa phân tử
2.2.2.1. Sự ion hóa
Nguyên tắt chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử trung hoà thành ion phân tử và các ion dƣơng mảnh có số khối z = m/e (m là khối lƣợng còn e là điện tích ion). Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhân thu đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà bằng các phân tử mang năng lƣợng cao sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng hoặc phá vỡ thành mảnh ion và các gốc theo sơ đồ sau:
ABCD + e → ABCD++ 2e → ABCD+++ 3e
→ ABCD-
26
điện tích +2 hoặc ion âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc ion gốc, các gốc hoặc phân tử trung hoà nhỏ hơn:
ABCD+ + e → ABC- + D+ → AB- + CD+
→ A+ + BCD → A + BCD+
→ ….
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và năng lƣợng bắn phá. Quá trình này là quá trình ion hoá. Các ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và điện tích e, tỷ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó, tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa các xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z thì đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng.
2.2.2.2. Phân loại các ion
- Ion phân tử
Ion phân tử đƣợc hình thành do mất đi 1 electron, cho nên khối lƣợng của nó chính là khối lƣợng của phân tử hay trọng lƣợng phân tử, đƣợc kí hiệu là M+. Ion phân tử có các tính chất sau:
+ M+ là ion có khối lƣợng lớn nhất chính là trọng lƣợng phân tử + M+ là ion với thế xuất hiện nhỏ nhất.
+ M+ là số chẵn nếu phân tử không chứa dị tố N hay chứa một số chẵn dị tố N và M+ sẽ là số lẽ nếu chứa một số lẻ dị tố N.
+ Tất cả sự phá vỡ phân tử đều có thể tính từ hiệu số khối lƣợng của các phân tử ion với ion phân tử.
+ Cƣờng độ của M+ tỷ lệ với áp suất mẫu. Nó phụ thuộc vào dãy hợp chất,