Phương pháp phân tích thí nghiệm

2.2.2.1. Ước tính nhu cầu DMI (Dry matter intake) [6],[7],[49] - Nhu cầu DMI (kg/ngày) được ước tính theo công thức sau:

DMI (kg/ngày) = (0,372 x FCM + 0,0968 x BW^0,75) x (1 – e^{(-0,192 x (WOL + 3,67)}) Trong đó:

FCM (Fat corrected milk): năng suất sữa tiêu chuẩn có tỷ lệ béo 4% (kg/ngày). BW (Body weight): trọng lượng cá thể (kg).

WOL (week of lactation): tuần khai thác sữa.

- Công thức quy đổi từ năng suất sữa có tỷ lệ béo bất kỳ sang năng suất sữa tiêu chuẩn:

FCM = S (0,4 + 0,15 x M) Trong đó:

FCM (Fat corrected milk): năng suất sữa tiêu chuẩn có tỷ lệ béo 4% (kg/ngày). S : năng suất khai thác sữa thực tế (kg/ngày).

M: Tỷ lệ béo sữa thực tế (%).

2.2.2.2. Ước tính nhu cầu ME (Metabolizable energy) [6],[7],[49] - Nhu cầu ME (Mcal/ngày) cho duy trì được ước tính theo công thức:

MEM (Mcal/ngày) = 0,12 x BW^0,75

- Nhu cầu ME (Mcal/ngày) cho sản suất sữa được ước tính theo công thức: MEL (Mcal/ngày) = FCM x 1,2

- Đối với các cá thể đang khai thác sữa tại kỳ cho sữa thứ 1 và thứ 2, nhu cầu ME phải tính cả nhu cầu ME dành cho tăng trưởng.

 Kỳ cho sữa thứ 1: MEG (Mcal/ngày) = 0,2 x MEM

 Kỳ cho sữa thứ 2: MEG (Mcal/ngày) = 0,1x MEM

- Nhu cầu ME (Mcal/ngày) của các cá thể bò sữa không mang thai nuôi nhốt hoàn toàn được tính theo công thức sau:

ME (Mcal/ngày) = MEM + MEG + MEL Trong đó:

42

MEM: nhu cầu ME dành cho duy trì (Mcal/ngày). MEG: nhu cầu ME dành cho tăng trưởng (Mcal/ngày). MEL: nhu cầu ME dành cho sản suất sữa (Mcal/ngày).

FCM (Fat corrected milk): năng suất sữa tiêu chuẩn có tỷ lệ béo 4% (kg/ngày). BW (Body weight): trọng lượng cá thể (kg).

2.2.2.3. Ước tính nhu cầu protein thô (CP - Crude protein) [6],[7],[49]

- Nhu cầu protein thô (g/ngày) cho duy trì được ước tính theo công thức: CPM (g/ngày) = 4 x BW^0,75

- Nhu cầu protein thô (g/ngày) cho sản suất sữa được ước tính theo công thức: CPL (g/ngày) = 85 x FCM

- Đối với các cá thể đang khai thác sữa tại kỳ cho sữa thứ 1 và thứ 2, nhu cầu protein thô phải tính cả nhu cầu protein thô dành cho tăng trưởng.

CPG = 380 x W

- Như vậy nhu cầu protein thô (g/ngày) của các cá thể được tính như sau: CP (g/ngày) = CPM + CPG + CPL

Trong đó:

CP: nhu cầu protein thô hằng ngày của cá thể (g/ngày). CPM: nhu cầu protein thô dành cho duy trì (g/ngày). CPG: nhu cầu protein thô dành cho tăng trưởng (g/ngày). CPL: nhu cầu protein thô dành cho sản suất sữa (g/ngày).

FCM (Fat corrected milk): năng suất sữa tiêu chuẩn có tỷ lệ béo 4% (kg/ngày). BW (Body weight): trọng lượng cá thể (kg).

W: tăng trọng từng cá thể (kg)

2.2.2.4. Ước tính nhu cầu về calcium [6],[7],[49]

- Nhu cầu Calcium (g/ngày) cho duy trì được ước tính theo công thức: CaM (g/ngày) = 0,031 x BW

- Nhu cầu Calcium (g/ngày) cho sản suất sữa được ước tính theo công thức: CaL (g/ngày) = 2,1 x FCM

43

- Nhu cầu Calcium (g/ngày) cho tăng trưởng được ước tính theo công thức: CaG (g/ngày) = (9,83 x MW^0,22 x BW^-0,22) x WG

- Như vậy nhu cầu Calcium (g/ngày) của các cá thể được tính theo công thức: Ca (g/ngày) = CaM + CaG + CaL

Trong đó:

Ca: nhu cầu Calcium hằng ngày của cá thể (g/ngày). CaM: nhu cầu Calcium dành cho duy trì (g/ngày). CaG: nhu cầu Calcium dành cho tăng trưởng (g/ngày). CaL: nhu cầu Calcium dành cho sản suất sữa (g/ngày).

FCM (Fat corrected milk): năng suất sữa tiêu chuẩn có tỷ lệ béo 4% (kg/ngày). BW (Body weight): trọng lượng cá thể (kg).

MW (expected mature live body weight): trọng lượng mong đợi của cá thể (kg). WG (weight gain): tăng trọng từng cá thể (kg)

2.2.2.5. Ước tính nhu cầu về phospho [6],[7],[49]

- Nhu cầu Phospho (g/ngày) cho duy trì được ước tính theo công thức: PM (g/ngày) = 1 x DMI + 0,002 x BW

- Nhu cầu Phospho (g/ngày) cho sản suất sữa được ước tính theo công thức: PL (g/ngày) = 0,9 x FCM

- Nhu cầu Phospho (g/ngày) cho tăng trưởng được ước tính theo công thức: PG (g/ngày) = (1,2 + (4,635 x MW^0,22 x BW^-0,22)) x WG

- Như vậy nhu cầu Phospho (g/ngày) của các cá thể được tính theo công thức: P (g/ngày) = PM + PG + PL

Trong đó:

P: nhu cầu Phospho hằng ngày của cá thể (g/ngày). PM: nhu cầu Phospho dành cho duy trì (g/ngày). PG: nhu cầu Phospho dành cho tăng trưởng (g/ngày). PL: nhu cầu Phospho dành cho sản suất sữa (g/ngày). DMI (Dry matter intake): lượng chất khô ăn vào (kg/ngày).

44

BW (Body weight): trọng lượng cá thể (kg).

MW (expected mature live body weight): trọng lượng mong đợi của cá thể (kg). WG (weight gain): tăng trọng từng cá thể (kg).

2.2.2.6. Xác định hàm lượng chất khô [4],[10]

- Nguyên lý: Ẩm độ là lượng nước từ mẫu vật bị bay hơi qua quá trình sấy. Vật chất khô được xem như là phần còn lại sau khi sấy.

- Phương pháp tiến hành:

 Sấy mẫu ở nhiệt độ 100 - 105^oC đến trọng lượng không đổi.  Làm nguội mẫu đã sấy trong bình hút ẩm 30 - 45 phút.  Cân lại trọng lượng hộp mẫu sau khi để nguội.

- Công thức tính: 1 2 m 100 * m  x

Trong đó: x: hàm lượng vật chất khô (%). m1: trọng lượng mẫu ban đầu (g).

m2: trọng lượng mẫu còn lại sau khi sấy (g).

2.2.2.7. Xác định hàm lượng nitrogen tổng bằng phương pháp Kjeldahl và hàm lượng protein thô. [4],[9]

- Nguyên lý:

Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nitrogen bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitrogen chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối ammonium sulfate.

- Phương pháp tiến hành:  Vô cơ hoá nguyên liệu:

Tiến hành vô cô hóa nguyên liệu trong bình Kjeldahl bằng H2SO4 đặc cùng hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 trong tủ Hoffer cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Để nguội. Chuyển dung dịch sang bình định mức, tráng bình Kjeldahl bằng nước cất vô đạm và dẫn nước cất đến vạch định mức.

45  Cất đạm:

Cho vào bình hứng 10ml dung dịch H2SO4 N/100 và 3 giọt metyl đỏ. Cho 10ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng vào phễu của máy cất đạm. Tiếp tục cho 10ml dung dịch NaOH đậm đặc vào phễu. Tráng phễu bằng nước cất. Thực hiện lôi cuốn bằng hơi nước trong 5 phút rồi hạ bình hứng NH3 xuống để thêm 3 phút nữa.

 Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH.

Định phân lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH N/100. Xác định hệ số hiệu chỉnh bằng dung dịch (COOH)2 N/100 được chuẩn độ bởi dung dịch NaOH N/100.

- Công thức tính:  Công thức tính hệ số hiệu chỉnh x: ) 100 / ( ) 100 / ((COOH)₂ N NaOH V N V x Trong đó: x: hệ số hiệu chỉnh.

V (COOH)2 N/100: thể tích dung dịch (COOH)2 N/100 cho vào mỗi erlen (ml).

V NaOH N/100: thể tích dung dịch NaOH N/100 cho vào mỗi erlen (ml).

 Công thức tính hàm lượng N-tổng: m x V V N_T ^{14*( t)* *10 *100} % 4 0   

Trong đó:%NT: hàm lượng N-tổng có trong mẫu.

Vo:thể tích NaOH N/100 trung bình của 2 lần thử không. Vt: thể tích NaOH N/100 trung bình của 3 lần thử thật. x: hệ số hiệu chỉnh.

m: khối lượng mẫu đem xác định đạm (g).  Công thức tính hàm lượng protein thô:

25 , 6 * % %CP N_T

46

Trong đó: % CP: hàm lượng protein thô có trong mẫu. %NT : hàm lượng N-tổng có trong mẫu.

2.2.2.8. Xác định hàm lượng calcium. [4] - Nguyên lý:

Sau khi vô cơ hoá thực phẩm, oxalat ammonium sẽ làm trầm hiện hoàn toàn ion Ca có sẵn trong dung dịch nếu thoả mãn những điều kiện sau:

 Môi trường có pH lớn hơn 4.

 Dung dịch (COONH4)2 phải bão hoà sôi và được đổ vào 1 lần.  Làm lạnh ngay hỗn hợp sau khi đã đun sôi 1 phút.

Lọc, rửa kết tủa và định lượng bằng KMnO4 trong môi trường H2SO4.

- Phương pháp tiến hành:

 Nung mẫu ở nhiệt độ 550 - 600^oC thành tro trắng. Thêm vào nước cất và vài giọt HCl đậm đặc. Chuyển mẫu vào bình định mức, định mức bằng nước cất và thêm vào vài giọt metyl đỏ. Trung hoà HCl thừa bằng NH4OH 10%. Thêm acid acetic loãng để đưa pH về từ 5 đến 5,2.

 Đun sôi dung dịch, khi vừa sôi cho vào (COONH4)2 bão hoà. Đun tiếp 30 giây, làm lạnh nhanh erlen bằng nước lạnh từ 20 – 30 phút. Lọc và rửa trầm hiện ra bằng nước cất cho đến khi hết ion (COO)^2-. Cho cả giấy lọc có chứa trầm hiện vào erlen, cho tiếp vào H2SO4 1N. Đun cho đến khi bốc khói nhẹ, định phân (COOH)2 bằng KMnO4 0,02N.

- Tính kết quả: Hàm lượng Ca (%) = Trong đó: V: thể tích KMnO4 N/50 dùng để chuẩn độ (ml). m: trọng lượng mẫu thử (g). V 25.m

47

2.2.2.9. Xác định Hàm lượng phospho. [4] - Nguyên tắc:

Khi phosphate tác dụng với molypdat ammonium sẽ tạo ra phosphomolypdat có màu vàng, khử phosphomolypdat vàng sang dạng màu xanh molypden. Độ đậm của màu sắc tỷ lệ với hàm lượng phospho trong mẫu.

- Phương pháp tiến hành:

 Hỗn hợp A gồm thuốc thử Molypdic và H2SO4 đậm đặc.

 Dung dịch B gồm: Metabisulfit Natri, hydroquinon và nước cất.

 Cân mẫu, cho vào NaOH và ít nước cất. Nung đến khi không còn bốc khói. Cho vào lò vô cơ hoá trong 15 phút, thêm H2SO4 2N, đun đến gần cạn. Pha loãng thành 100ml. Dựng đường chuẩn và định lượng:

Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn và định lượng phospho

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Mẫu

- Dung dịch phospho chuẩn 10ppm. - Nước cất (ml) - Nồng độ phospho (ppm). - Dung dịch cần định lượng (ml) - Hỗn hợp A (ml). - Dung dịch B (ml). 0 5 0 0 1 2 1 4 2 0 1 2 2 3 4 0 1 2 3 2 6 0 1 2 4 1 8 0 1 2 5 0 10 0 1 2 0 0 x 5 1 2  Đun cách thuỷ các ống nghiệm trong 10 phút, sau đó làm lạnh dưới

vòi nước. Thêm đủ nước cất cho đủ 25ml, đo mật độ quang ở 700nm. - Tính kết quả:

 Dựng đường chuẩn mật độ quang của các mẫu thử.

 Dựa vào đường chuẩn tính nồng độ x của dung dịch trong mẫu.

2.2.2.10. Xác định hoạt độ amylase. [5] - Nguyên tắc:

Amylase xúc tác phản ứng thuỷ phân tinh bột thành đường. Lượng tinh bột còn lại phản ứng màu với Iod. Xác định lượng tinh bột bị thuỷ giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa:

Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thuỷ giải bởi 1g nguyên liệu chứa enzyme trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (50^oC, pH6).

48 - Phương pháp tiến hành:

 Dựng đường chuẩn tinh bột:

Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn tinh bột

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Tinh bột 10mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5

Dung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0

Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10

Hút 0,1ml dung dịch từ các ống nghiệm thêm vào 0,9 ml đệm và 9ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần. So màu ở bước sóng 560nm và vẽ đồ thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị OD.

 Phản ứng enzyme:

Bảng 2.3 Tiến hành xác định hoạt độ amylase trong mẫu

Dung dịch hoá chất ^{Ống nghiệm}

Thử thật (3 ống) Thử không ( 3 ống)

Tinh bột 1% (ml) 1 1

NaCl 0,1% (ml) 1 1

Đệm Phosphate pH 6 (ml) 2 2

Lắc đều, để ổn nhiệt ở 50⁰C trong 5 phút

Dung dich enzyme (ml) 1 0

Để ổn nhiệt ở 50⁰C trong 5 phút

Dung dịch HCl 0,1N (ml) 5 5

Dung dịch enzyme (ml) 0 1

Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên. Thêm vào mỗi ống nghiệm 9ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần.

Lắc đều, đo OD tại bước sóng 560nm. - Công thức tính hoạt độ amylase:

t m K X * * Hđ  Trong đó: Hđ: hoạt độ amylase (UI/g).

X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn (mg). K: hệ số pha loãng.

t: thời gian enzyme phản ứng (phút).

49

2.2.2.11. Xác định hoạt độ cellulase. [4]

- Nguyên tắc:

Cellulase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase). Để xác định hoạt độ cellulase, sử dụng CMC (carboxyl methyl cellulose) như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 24 giờ ở pH 5,5. Cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt độ enzyme cellulase theo định nghĩa:

Một đơn vị hoạt độ tương ứng với một microgam glucose tạo ra trong thời gian thuỷ phân cơ chất CMC 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Phương pháp tiến hành:

Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml dịch chiết, 3ml dịch cơ chất, 3ml dung dịch đệm. Ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ, lọc qua giấy lọc để thu phần dịch trong. Lấy 1ml dịch lọc xác định hàm lượng glucose tạo thành theo phương pháp Miller. - Công thức tính hoạt độ cellulase:

m v V K X Hđ * * * 7 * 

Trong đó: Hđ: hoạt độ cellulase (UI/g).

X: hàm lượng glucose trong dịch thí nghiệm. 7: thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml)

K: hệ số pha loãng.

V: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml). v: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (ml)

m: trọng lượng chế phẩm enzyme sử dụng (g).

2.2.2.12. Xác định hoạt độ protease. [5]

- Nguyên tắc:

Khi protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa:

50

Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1g hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5^oC, pH 7.6).

- Phương pháp tiến hành:

 Dựng đường chuẩn tyrosine:

Bảng 2.4 Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Dung dịch HCl 0.2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2 2 2 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Lượng tyrosine (µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Lắc và để yên 10 phút, mang đo mật độ quang ở bước sóng 660nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosine ở các ống (µmol).

 Phản ứng enzyme:

Bảng 2.5 Xác định lượng tyrosine trong mẫu

Dung dịch hoá chất ^{Ống nghiệm}

Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống)

Casein 1% (ml) 5 5

TCA 10% (ml) 0 5

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 0

Lắc đều và giữ 35,5⁰C, trong 30 phút

TCA 10% (ml) 5 0

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0 1

Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu

Dịch lọc 1 1

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6

Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm - Công thức tính hoạt độ protease:

m v t K V x Hđ * * * * 

51 Trong đó: Hđ: hoạt độ protease (UI/g).

x: hàm lượng tyrosine suy ra từ đường chuẩn. V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).

K: độ pha loãng của mẫu. t: thời gian phản ứng (phút).

m: lượng mẫu sử dụng để chiết protease (g).

2.2.2.13. Xác định hàm lượng tinh bột. [9]

- Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thuỷ phân thành đường glucose, xác định lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột. (C6H10O5)n + nH2O n C6H12O6 162,1 18,02 180,12 90 , 0 12 , 180 1 , 162   F - Phương pháp tiến hành:

Cân 1g mẫu cần phân tích nghiền nhỏ, cho vào bình cầu dung tích 100ml. Cho thêm vào 50ml nước cất, lắc đều, giữ yên 30-45 phút, lọc bỏ nước lọc để loại bỏ đường tan. Rửa mẫu bằng nước cất hai lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển mẫu vào bình cầu bởi 25ml dung dịch HCl 5%. Đậy kín bằng nút cao su có lắp ống làm lạnh hồi lưu. Đun cách thuỷ hỗn hợp 3-5 giờ. Thử sự thuỷ phân hoàn toàn của tinh bột bằng dung dịch iod. Làm nguội, trung hoà hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH 5.6 - 6.9 (bỏ trực tiếp mẫu giấy quỳ vào bình). Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc.

Định lượng đường glucose trong dung dịch theo phương pháp Miller. - Công thức tính hàm lượng tinh bột:

w x V a

52

Trong đó: X: hàm lượng tinh bột (%). a: nồng độ glucose (mg/ml). V: thể tích dịch lọc (ml).

x: hệ số pha loãng dịch lọc để định lượng đường. w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)

100: hệ số tính chuyển thành %.

0.9: hệ số quy chuyển glucose thành tinh bột.

2.2.2.14. Xác định hàm lượng cellulose. [9]

- Nguyên tắc:

Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền của chất này, không bị phân huỷ dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin, … ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hoá, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric