2.6.1. Trên thế giới
Rượu vang rất được ưu chuộng trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Âu. Theo thống kê hàng năm Ý và Pháp thường có lượng sản xuất rượu vang đứng đầu trên thế giới.
Bảng 7: Sản xuất rƣợu vang trên thế giới năm 2007
Hạng Quốc gia Sản lƣợng (tấn) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Italy France Spain United States Argentina China South Africa Australia Germany Chile 5.050.000 4.711.600 3.645.000 2.300.000 1.550.000 1.450.000 1.050.000 961.972 891.600 827.746
(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Wine ngày 22/7/2013)
Theo Hồ Thanh Trúc (2010), tình hình một số loại rượu vang nổi tiếng trên thế giới như sau:
+ Rƣợu vang Pháp
Vùng Alsace, nổi tiếng về rượu vang trắng. Sản lượng rượu vang trắng của Alsace chiếm 30% tổng sản lượng rượu vang trắng của Pháp. Rượu vang trắng ở đây có tên gọi duy nhất là Vang Alsace.
không có các vườn nho cỡ lớn mà chỉ có những vườn nho thuộc diện gia đình, diện tích chỉ khoảng 50 ha nhưng lại có đến 56 ông chủ vườn. Phần đông các chủ vườn đều bán nho cho các tiệm rượu để họ pha chế và bán ra thị trường.
Vùng Bordeaux, sản xuất rượu vang nổi tiếng và quan trọng của Bordeaux là: Médoc, Haut Médoc, Graves Barsac, Sauternes, St Emilion, Pomerol, Cérons, Loupiac, Pronsac, Bourg.
Vùng Champagne, sản xuất rượu vang tinh tế, quí tộc mà không nơi nào trên thế giới bì kịp. Nhờ vào giống nho, điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nhất là kĩ thuật sản xuất và kinh nghiệm nên nước Pháp đã sản xuất loại rượu vang đặc biệt này. Phần lớn rượu Champagne được sản xuất từ giống nho đỏ thẫm Pinot Noir có chất đường, nước trắng nên độ rượu mạnh và giống như Chardonnay có màu vàng kim, đem lại vị thanh cao và hương thơm.
+ Rƣợu vang Mỹ
Rượu vang thương phẩm (Branded Wine).
Rượu vang thông dụng (Generic Wine) như: Vang California Burgundy. Rượu vang pha trộn (Blended Wine), trên nhãn ghi American Wine. + Rƣợu vang Đức
Rượu vang bàn (Deutcher Tafewein). Rượu vang vùng (Landwein).
Rượu vang Qualitatswein bestimmter Anbuagebiete (QbA).
Rượu vang Qualitatswein mit Pradikat: là loại rượu vang chất lượng cao (QmP).
2.6.2. Tại Việt Nam
Theo Hồ Thanh Trúc (2010), ở nước ta hiện nay có vài công ty sản xuất rượu vang nổi tiếng như:
+ Rượu vang Đà Lạt (Công ty Ladofoods). + Công ty liên doanh Việt - Đức (Van - Gres).
+ Vang Thanh Long, vang Thành Long, vang Viết Nghi.
- Những khó khăn trong sản xuất rƣợu vang ở nƣớc ta:
+ Nho vùng nhiệt đới không cho sản phẩm rượu chất lượng cao.
+ Thị trường tiêu thụ chưa mạnh.
+ Thuế rượu nhập khẩu có xu hướng ngày càng giảm. - Tiềm năng phát triển
+ Việt Nam là một quốc gia đông dân vì thế sức tiêu thụ rất lớn.
+ Việt Nam không lạ lẫm với rượu vang bởi ảnh hưởng khá đậm nét của văn hoá Châu Âu, Châu Mỹ, nhất là văn hoá Pháp.
+ Việt Nam đang là nước rất có tiềm năng trong thu hút khách du lịch quốc tế.
2.6.3. Một số nghiên cứu rƣợu vang trong nƣớc - Rƣợu vang thanh long
Đề tài Khảo sát ảnh hưởng của một số chủng nấm men trong sản xuất rượu vang thanh long (Đàm Sao Mai et al., 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện cho sản phẩm rượu thích hợp nhất khi sử dụng phối hợp 50% nấm men Saccharomyces ovitomis, 50% nấm men Saccharomyces vini, độ Brix ban đầu là 23,7. Sản phẩm rượu vang thanh long thu nhận đạt được hàm lượng ethanol (độ cồn) là 12%v/v, pH là 3,48; độ Brix là 6,27.
- Rƣợu vang sơ ri (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu sơ ri (Trần Thị Thuỳ Trang, 2003). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là sơ ri, được thực hiện 15 tuần và cho ra những kết quả như sau: pH thích hợp lên men là 4,3; độ Brix là 22, thời gian kết thúc quá trình lên men là 14 ngày.
- Rƣợu vang mía
Đề tài Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang mía (Lý Huỳnh Liên Hương et al., 2009). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là nước mía, được thực hiện 6 tháng và cho ra những kết quả như sau: Nguồn nấm men sử dụng là nấm men thị trường với mật số là 106
tế bào/ml, thanh trùng nguyên liêu bằng NaHSO3 140 mg/l trong 30 phút, độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4, thời gian lên men là 5 ngày ở 30oC.
- Rƣợu vang bƣởi
Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu vang bưởi da xanh (Mai Thị Tươi, 2007). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là bưởi da xanh, được thực hiện trong 3 tháng và cho ra những kết quả như sau: Tỉ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình lên men rượu là 1: 0,5
(1 lít dịch quả thêm vào 0,5 lít nước, độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4,2; thời gian lên men là 8 ngày.
- Rƣợu vang chuối Xiêm
Đề tài Ứng dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối (Trần Ngọc Điệp, 2008). Đề tài có thể sử dụng nguồn nguyên liệu là chuối Xiêm, thời gian thực hiện là 12 tháng và cho những kết quả như sau: Việc sử dụng chế phẩm pectinase ở nồng độ 0,02% và chitosan ở nồng độ 0,01% cho sản phẩm có độ trong tốt. Tuy nhiên, sử dụng chitosan cho sản phẩm rượu trong hơn so với việc sử dụng pectinase. Thời gian lên men phụ ít nhất là 2 tháng và nhiệt độ lên men thích hợp là 10oC.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện – vật liệu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Thời gian thực hiện 20 tuần (từ tháng 6/2013 đến tháng 11/2013).
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Xoài được mua ngoài thị trường ở 2 địa điểm: Đồng Tháp, Cần Thơ thuộc giống xoài Cát Chu. Bởi giống xoài này hiện được trồng phổ biến, có giá trị kinh tế cao và chất lượng đứng thứ hai (chỉ sau giống xoài Cát Hòa Lộc) trong các giống xoài hiện nay. Xoài dùng cho các thí nghiệm được chọn là những trái xoài có độ chín vừa phải, màu sắc vàng tươi, cuống quả còn mới, không có nhiều vết đen, độ Brix đạt từ 14-15.
Hình 3. Độ chín quả xoài đƣợc chọn để tiến hành các thí nghiệm
Nấm men Saccharomyces cerevisiae (dòng Mỹ) từ trường Đại học Uc-Davis, Hoa Kỳ được bảo quản ở 4oC tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và dòng nấm men vừa phân lập từ lên men dịch quả xoài.
Khoai tây, agar, đường Biên Hòa mua ngoài thị trường.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ cần thiết dùng cho phòng thí nghiệm: - Kính hiển vi (Olympus BH2, BX41TF, made in Japan). - Buồng đếm hồng cầu, lame đếm.
- Máy đo pH với độ chính xác 0,01 (TichoLine Schott, made in Germany). - Cân điện tử với độ chính xác 0,01g (Sartorius, made in Germany).
- Chiết quang kế (hiệu ATA GG.N-1E, Brix 0-32%, made in Japan). - Dụng cụ chưng cất, cồn kế (made in Germany).
- Máy ép nguyên liệu (Panasonic, made in Japan).
- Tủ cấy vô trùng (Esco, made in Singapore), tủ ủ vi sinh (Sanyo, made in, Japan), tủ lạnh (made in Japan).
- Dụng cụ để phân lập nấm men: đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn,…
- Bộ tỉ trọng Hydrometer, micropipet, bình lên men, bình tam giác và một số dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm.
3.1.4. Hoá chất sử dụng
- Hoá chất thanh trùng: NaHSO3. - Hoá chất thay đổi pH: NaHCO3.
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường PGA (khoai tây-đường-agar) và môi trường PGY (khoai tây-đường-yeast extract) có bổ sung khoáng (Phụ lục 1, phần 1.2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. Nội dung và bố trí thí nghiệm 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xoài
Dịch xoài Bổ sung pectinase (Thí nghiệm 3)
Địa điểm (A1, A2)
Phối chế độ Brix (B1, B2) Phối chế độ Brix = 22 Phối chế độ Brix Phối chế pH = 4,2 (E1, E2, E3) Thành phần dịch quả (C1, C2) Phối chế pH
(F1, F2, F3) Lên men Thanh trùng bằng NaHSO3
Phân lập nấm men (140mg/l trong 2 giờ)
Nhân giống Chủng nấm men 106
tế bào/ml Chủng nấm men (trữ và sử dụng) (D1, D2, D3, D4, D5, D6, (G1, G2, G3)
D7, D8, D9, D10, D11, DT)
Thí nghiệm1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3
Hình 4. Sơ đồ quy trình tổng quát về phân lập nấm men từ dịch xoài 3.2.2. Phân lập và tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
a. Mục đích:
Phân lập, tách ròng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa chúng về dạng thuần khiết.
b. Cách tiến hành:
Tiến hành phân lập và tách ròng nấm men theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. - A: Thu mẫu giống xoài Cát Chu ở 2 địa điểm: A1: Đồng Tháp và A2: Cần Thơ, mỗi địa điểm thu một mẫu xoài với khối lượng từ 2-3kg.
- B: Lượng đường với 2 mức độ: B1: bổ sung đường đạt độ Brix = 22 và B2: không bổ sung đường (lên men tự nhiên).
thêm vỏ.
- Số bình lên men là 2 x 2 x 2 = 8
c. Cách tiến hành
- Xử lý nguyên liệu: Xoài được chia thành 2 phần: một phần rửa sạch, gọt vỏ thu lấy thịt xoài; một phần gọt vỏ cẩn thận thu lấy vỏ sau đó cắt nhỏ, bỏ hạt và thu lấy thịt xoài để riêng. Tiếp theo lấy phần thịt đem đi ép bằng thiết bị ép thu dịch quả.
- Phối chế: Dùng Brix kế để đo dộ Brix của dịch quả, ghi nhận lại kết quả vừa đo (Phụ lục 2, phần 2.1). Sau đó cho 100 ml dịch quả vào bình lên men có bổ sung thêm đường để đạt độ Brix theo yêu cầu thí nghiệm là Brix = 22 (Phụ lục 1) và không bổ sung thêm đường. Đối với nghiệm thức bổ sung vỏ thì ta bổ sung vào 50 gram/100 ml dịch quả.
- Lên men dịch quả: Đậy kín bình lên men bằng waterclock để quá trình lên men xảy ra tốt hơn.
- Sau 1-2 ngày quan sát quá trình lên men, khi quá trình xảy ra mạnh (quan sát số bọt khí xuất hiện trong bình lên men), tiến hành cấy dịch lên men lên đĩa petri bằng cách dùng micropipet lấy 0,1ml dịch lên men và nhỏ lên bề mặt đĩa môi trường đã được chuẩn bị (Phụ lục 2). Dùng que cấy gạt trãi đều dịch lên men lên bề mặt môi trường để tìm các giống nấm men.
- Công tác phân lập được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và các dụng cụ, môi trường phải được khử trùng. Sau khi cấy xong lật úp đĩa và đặt vào tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 37o
C trong 24-48 giờ, đem ra quan sát qua kính lúp, chọn những khuẩn lạc đứng tách biệt có màu sắc, hình dáng khác nhau, lấy để cấy chuyển mỗi loại vào từng đĩa petri có đánh số kí hiệu.
- Quan sát bằng kính lúp, nhận diện các khuẩn lạc đơn lẻ, trắng đục tiếp tục cấy chuyển như trên vài lần để đảm bảo độ thuần khiết của giống vừa phân lập. Xác định độ ròng của giống bằng cách quan sát hình dạng, màu sắc và đo kích thước của khuẩn lạc nấm men (dưới kính lúp), sau đó quan sát hình dạng và đo kích thước của tế bào nấm men dưới kính hiển vi.
Cấy truyền để bảo tồn giống vừa phân lập. Nhân giống trong ống nghiệm và trong bình tam giác để phát triển sinh khối dùng cho lên men và để trữ giống.
- Sơ đồ thí nghiệm:
Ép lấy dịch quả ở 2 địa điểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A1: Đồng Tháp A2: Cần Thơ
Thêm đường Không thêm Thêm đường Không thêm
Thêm vỏ Không thêm vỏ
Lên men tự nhiên (1-2 ngày)
Cấy lên đĩa pêtri
Phân lập
Tách ròng và làm thuần
Kiểm tra độ thuần
Cấy truyền
Nhân giống trong ống nghiệm và bình tam giác Trữ ống trong tủ lạnh 4oC Sử dụng lên men
Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch xoài lên men.
d. Các chỉ tiêu theo dõi
- Số nấm men thuần phân lập được (tổng số 27 dòng).
- Hình dạng, màu sắc và kích thước của tế bào nấm men khi quan sát ở kính hiển vi.
- Hình dạng, kính thước, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc của nấm men. - Định danh sơ bộ các dòng nấm men phân lập dựa trên khoá phân loại. - Hình chụp các khuẩn lạc và tế bào nấm men.
3.2.3. Tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh
a. Mục đích:
Các chủng nấm men thuần khiết có sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng, khả năng tạo cồn và chịu cồn. Qua thí nghiệm này nhằm chọn ra nấm men thích hợp cho lên men rượu (hoạt lực lên men mạnh, nồng độ cồn cao).
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là nấm men phân lập được. Trong 27 dòng nấm men phân lập được từ thí nghiệm phân lập, chọn 14 dòng nấm men và sử dụng dòng Mỹ làm dòng nấm men đối chứng, với cùng 1 mức độ/mật số chủng 106 tế bào/ml dịch lên men và 2 lần lặp lại.
Số nghiệm thức là 15 nghiệm thức x 2 lần lặp lại = 30 đơn vị thí nghiệm. (Bố trí thí nghiệm song song trong chai Durham và trong bình tam giác).
c. Cách tiến hành: - Sơ đồ thí nghiệm: 100ml dịch quả Điều chỉnh pH = 4,2; độ Brix = 22o
Thanh trùng bằng NaHSO3 trong 30 phút
Chủng các giống nấm men (106 tế bào/ml)
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7
Lên men
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khảo sát tốc độ lên men (lượng CO2 sinh ra)
Lắng lọc
Phân tích các chỉ tiêu (đo pH, độ đường, độ cồn)
Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men cao.
Sử dụng chai Durham (cấu tạo gồm: chai thuỷ tinh có nắp đậy và ống thuỷ tinh úp ngược) để khảo sát sự lên men của các dòng nấm men.
Chuẩn bị dịch nấm men: Nuôi nấm men thuần vừa phân lập trong môi trường nhưng không có agar ở 30oC, trong 24 giờ. Nấm men thuần dùng trong phòng thí nghiệm: hồi sinh nấm men khô trong nước cất, ủ trong 30 phút. Tiến hành đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (Phụ lục 1, phần 1.3).
Cho 100ml dịch quả đã điều chỉnh về pH = 4,2 và độ Brix = 22o vào mỗi bình tam giác thanh trùng bằng NaHSO3 140 mg/l trong 30 phút. Sau đó chủng các dòng nấm men cần khảo sát vào, với mật số 106
tế bào/ml (100ml dịch quả + 1 ml dịch giống nấm men). Khuấy trộn cho nấm men phân tán đều trong các bình lên men. Dùng bông gòn đậy kín các bình lên men để quá trình lên men xảy ra ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Quan sát quá trình lên men và tiến hành phân tích các chỉ tiêu khi kết thúc quá trình lên men (quan sát thấy hết sủi bọt khí).
Bố trí thí nghiệm trong chai Durham song song với bố trí thí nghiệm trong bình tam giác. Cho 9 ml dịch quả lên men như trên vào chai Durham. Sau đó cho 1ml dung dịch các dòng nấm men (với mật số 106
tế bào/ml) cần khảo sát, ủ ở nhiệt độ phòng (28-30oC) quan sát và ghi nhận thời gian làm đầy ống Durham bởi CO2 của các dòng nấm men. Dòng nấm men nào làm đầy ống Durham sớm nhất thì biểu hiện cường độ lên men mạnh nhất.
d. Các chỉ tiêu theo dõi
- Cột khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men (theo phương pháp quan sát chiều cao của cột khí do CO2 sinh ra).
- Lượng đường trước và sau khi lên men (sử dụng Brix kế để đo). - Lượng cồn sinh ra sau khi lên men bằng phương pháp chưng cất. - pH trước và sau khi lên men (bằng pH kế).
Kết hợp cột khí CO2 quan sát ở chai Durham và các tiêu chí theo dõi ở quá trình lên men trong bình tam giác để chọn ra nấm men có cường độ lên men tốt nhất.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên quá trình lên men rƣợu
a. Mục đích:
Sử dụng dòng nấm men Saccharomyces (CKV1) có hoạt lực lên men mạnh được tuyển chọn từ thí nghiệm tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh để tìm ra tỉ lệ nấm men, độ Brix, độ pH thích hợp nhất cho quá trình lên men.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số với 3 nhân tố,