Định danh sơ bộ một số dòng nấm men phân lập được dựa vào một số đặc điểm hình thái và sinh lý của nấm men (Phụ lục 1, phần 1.5) :
+ Dựa vào đặc điểm hình thái bao gồm: quan sát và mô tả đặc tính nuôi cấy, hình thái nấm men, kích thước tế bào nấm men và sự hình thành tế bào nảy chồi trên môi trường malt-yeast-glucose-pepton, sự hình thành bào tử khi nuôi cấy trên môi trường thạch-nước.
+ Dựa vào đặc tính sinh lý bao gồm: khả năng lên men 2 loại đường (gồm đường glucose và saccharose) và khả năng đồng hóa urea trên môi trường Christensen của nấm men.
a. Đặc điểm hình thái của 27 dòng nấm men phân lập
Dựa vào Bảng 9 và Bảng 10, từ kết quả phân lập cho thấy 27 dòng nấm men có thể xếp thành các nhóm hình dạng đặc trưng như sau:
- Nhóm 1: nhóm nấm men hình cầu nhỏ, gồm các dòng nấm men CKV1, CĐV6, CKV2, CKK5, ĐĐV4, ĐKV2, ĐKK3, ĐKK4.
- Nhóm 2: nhóm nấm men hình cầu lớn, gồm các dòng nấm men CĐV7, CKK2, CKK3, CKK4, ĐĐV2, ĐĐV5, ĐKV1.
- Nhóm 3 nhóm nấm men hình oval, gồm các dòng nấm men CĐV4, CĐV5, CKK1, ĐKK1, ĐKK2, ĐĐV3.
CĐV2, CĐV3.
- Nhóm 5, nhóm nấm men hình trụ, gồm dòng nấm men ĐĐV1. - Nhóm 6, nhóm nấm men dạng chuỗi, gồm dòng nấm men CĐV1.
(a) CĐV6 (b) ĐKV2 (c) CKK4 (d) ĐKV1 (e) CĐV5 (f) ĐĐV3 (g) CĐV2 (h) CĐV1 (i) ĐĐV1
Hình 9. Các nhóm hình dạng nấm men phân lập đƣợc tại Cần Thơ và Đồng Tháp (a), (b) Hình cầu nhỏ; (c), (d) Hình cầu lớn; (e), (f) Hình oval; (g) Hình elip dài; (h) Dạng chuỗi; (i)Hình trụ. (hình chụp ở vật kính 100)
b. Sự hình thành tế bào nảy chồi của 27 dòng nấm men khi nuôi cấy trên môi trường malt-yeast-glucose-pepton
(a) CĐV6 (b)CKK3 (c) ĐĐV2
(d) CĐK1 (e) ĐĐV1 (f) CĐV1
Hình 10. Tế bào nảy chồi của một số dòng nấm men(hình chụp ở vật kính 100) Thí nghiệm quan sát sự nảy chồi của các dòng nấm men cho thấy các dòng nấm men đều có khả năng nảy chồi và có 3 hình thức nảy chồi gồm: nảy chồi nhiều hướng,
nảy chồi lưỡng cực và nảy chồi một cực.
- Tế bào nảy chồi nhiều hướng bao gồm 3 nhóm hình dạng: hình cầu nhỏ (CKV1, CĐV6, CKV2, CKK5, ĐĐV4, ĐKV2, ĐKK3, ĐKK4), hình cầu lớn (CĐV7, CKK2, CKK3, CKK4, ĐĐV2, ĐĐV5, ĐKV1), hình oval (CĐV4, CĐV5, CKK1, ĐKK1, ĐKK2, ĐĐV3) và hình trụ (ĐĐV1).
- Tế bào nảy chồi lưỡng cực gồm nhóm hình dạng: hình elip dài (CĐK1, CĐK2, CĐV2, CĐV3).
- Tế bào nảy chồi một cực gồm nhóm dạng chuỗi (CĐV1).
c. Sự hình thành bào tử của 27 dòng nấm men trên môi trường thạch-nước
Kết quả quan sát sự hình thành bào tử của nấm men cho thấy cả 6 nhóm nấm men đều hình thành bào tử trên môi trường thạch-nước. Số lượng bào tử thay đổi ở mỗi nhóm:
- Nhóm 1: nhóm nấm men hình cầu nhỏ (CKV1, CĐV6, CKV2, CKK5, ĐĐV4, ĐKV2, ĐKK3, ĐKK4) xuất hiện từ 1 đến 4 bào tử hình tròn.
- Nhóm 2: nhóm nấm men hình cầu lớn (CĐV7, CKK2, CKK3, CKK4, ĐĐV2, ĐĐV5, ĐKV1) xuất hiện từ 1 đến 4 bào tử hình tròn.
- Nhóm 3 nhóm nấm men hình oval (CĐV4, CĐV5, CKK1, ĐKK1, ĐKK2, ĐĐV3) xuất hiện từ 1 đến 2 bào tử hình tròn.
- Nhóm 4, nhóm nấm men hình elip dài (CĐK1, CĐK2, CĐV2, CĐV3) xuất hiện từ 1 đến 4 bào tử hình tròn.
- Nhóm 5, nhóm nấm men hình trụ (ĐĐV1) xuất hiện từ 1-3 bào tử hình tròn. - Nhóm 6, nhóm nấm men dạng chuỗi (CĐV1) xuất hiện từ 1-2 bào tử hình tròn.
d) Sự thay đổi màu sắc môi trường Christensen khi nuôi cấy 27 dòng nấm men phân lập sau thời gian ủ 7 ngày
Trong môi trường Christensen có chứa chất chỉ thị màu phenol red nên môi trường có màu vàng. Khi nấm men có enzyme urease để phân giải urea tạo thành CO2 và NH3, chính NH3 làm pH môi trường tăng lên thì môi trường sẽ có màu hồng.
Hình 11 cho thấy khả năng đồng hóa urea trên môi trường Christensen của các dòng nấm men phân lập được.
(a) (b) (c)
(d)
Hình 12. Khả năng đồng hóa urea trên môi trƣờng Christensen.
Ống nghiệm môi trường khi chưa cấy nấm men. Từ trái sang phải (b) Nấm men phân lập được tại Cần Thơ: CĐV1, CĐV2, CĐV3, CĐV4, CĐV5, CĐV6, CĐV7, CĐK1, CĐK2 (c) Nấm men phân lập được tại Cần Thơ: CKV1, CKV2, CKK1, CKK2, CKK3, CKK4, CKK5; (d) Nấm men phân lập được tại Đồng Tháp: ĐĐV1, ĐĐV2, ĐĐV3, ĐĐV4, ĐĐV5, ĐKV1, ĐKV2, ĐKK1, ĐKK2, ĐKK3, ĐKK4.
Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy, các nấm men thuộc nhóm 1, 2, 3, 5, 6 không làm đổi màu môi trường Christensen. Các nấm men thuộc nhóm 4 (nhóm nhìn elip dài gồm: CĐK1, CĐK2, CĐV2, CĐV3) làm môi trường chuyển sang màu đỏ. Chứng tỏ các nấm men thuộc nhóm 1, 2, 3, 5, 6 không có khả năng sinh enzyme urease để phân giải urea. Các nấm men thuộc nhóm 4 có khả năng sinh enzyme urease để tạo ra CO2 và NH3.
e) Khả năng lên men các loại đường glucose và saccharose của 27 dòng nấm men trong ống nghiệm có ống Durham
Khả năng sử dụng đường glucose và saccharose của các dòng nấm men thể hiện ở Bảng 12.
Kết quả cho thấy các dòng nấm men thuộc các nhóm hình dạng: nhóm 1 (hình cầu nhỏ), nhóm 2 (hình cầu lớn), nhóm 3 (hình oval) và nhóm 5 (hình trụ) đều có khả năng lên men hai loại đường glucose và saccharose. Các nấm men thuộc nhóm 4 (hình elip dài) không có khả năng lên men cả hai loại đường này, nấm men thuộc nhóm 6 (dạng chuỗi) có khả năng lên men đường glucose nhưng lại không có khả năng lên men đường saccharose.
Bảng 12: Khả năng lên men đƣờng glucose và saccharose của 27 dòng nấm men phân lập Nhóm hình dạng nấm men Dòng nấm men Đƣờng glucose Đƣờng saccharose Nhóm 1 (hình cầu nhỏ) CKV1, CĐV6, CKV2, CKK5, ĐĐV4, ĐKV2, ĐKK3, ĐKK4
Tạo nhiều bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt từ 2,3 đến 3cm sau từ 3- 33 giờ lên men.
Tạo bọt trắng trên bề mặt. . Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt từ 1,6 đến 3cm sau từ 3-33 giờ lên men. Nhóm 2 (hình cầu lớn) CĐV7, CKK2, CKK3, CKK4, ĐĐV2, ĐĐV5, ĐKV1
Tạo nhiều bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt đến 3cm sau từ 3-33 giờ lên men.
Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt từ 1,6 đến 3cm sau từ 3-57 giờ lên men. Nhóm 3 (hình oval) CĐV4, CĐV5, CKK1, ĐKK1, ĐKK2, ĐĐV3 Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2
đạt từ 1,6 đến 3cm sau từ 2-33 giờ lên men.
Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt từ 1,3 đến 3cm sau từ 3-33 giờ lên men. Nhóm 4
(hình elip dài)
CĐK1, CĐK2,
CĐV2, CĐV3 Không lên men. Không lên men. Nhóm 5
(hình trụ) ĐĐV1
Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm.Chiều cao cột khí CO2
đạt đến 3cm sau 3 giờ lên men
Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2 đạt đến 3cm sau 5 giờ lên men.
Nhóm 6
(dạng chuỗi) CĐV1
Tạo bọt trắng trên bề mặt. Có váng bám xung quanh thành ống nghiệm. Chiều cao cột khí CO2
đạt từ 3cm sau 8 giờ lên men.
Không lên men.
Theo mô tả hình thái, phân loại sơ bộ về giống nấm men của Nguyễn Đức Lượng et al. (2009), Kurtzman et al. (1998) và Kreger-van Rij (1984), ta tiến hành định danh sơ bộ dựa trên các đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, có thể định danh sơ bộ 27 dòng nấm men như sau:
- Với mô tả giống nấm men Saccharomyces có tế bào sinh dưỡng nảy chồi nhiều hướng, hình cầu, hình oval, elip kéo dài tạo thành 1-4 bào tử hình tròn, bề mặt nhẵn, sử dụng đường lên men và không đồng hóa urea. Các dòng nấm men thuộc nhóm 1 (hình cầu nhỏ), 2 (hình cầu lớn), 3 (hình oval) có những đặc điểm gần giống như mô tả. Do đó, có thể kết luận các dòng nấm men phân lập thuộc nhóm 1, 2 và 3 là giống nấm men Saccharomyces.
- Kết quả định danh các dòng nấm men hình elip dài thuộc nhóm 4 tương tự với mô tả giống nấm men Pichia của Kurtzman et al. (1998) và Kreger-van Rij (1984) về khả năng nảy chồi, hình dạng bào tử, khả năng lên men đường và đồng hóa urea. Do đó, có thể kết luận nhóm 4 (CĐK1, CĐK2, CĐV2, CĐV3) là giống nấm men Pichia.
- Mô tả giống nấm men Candida của Nguyễn Đức Lượng et al. (2009) và Kurtzman et al. (1998) có hình oval hoặc hình trụ, nảy chồi đa cực, khuẩn lạc tăng trưởng hiếu khí là màu trắng gần với màu kem, mềm, mịn, sáng, sinh từ 1-4 bào tử có sự lên men đường và không đồng hóa urea. Dòng nấm men thuộc nhóm 5 (hình trụ) ĐĐV1 có những đặc điểm gần giống như mô tả. Do đó, có thể kết luận dòng nấm men thuộc nhóm 5 (ĐĐV1) là giống nấm men Candida.
- Giống Geotrichum được mô có khuẩn lạc màu trắng, phẳng, mịn và bìa nhăn. Sợi nấm lỏng lẻo và chia thành nhiều tế bào hình chữ nhật. Tế bào nảy chồi một cực, có thể sinh bào tử đốt, bào tử áo hoặc nội bào tử, có khả năng lên men đường nhưng không đồng hóa urea. Nấm men CĐV1 thuộc nhóm 6 (dạng chuỗi) có những đặc điểm gần giống với mô tả. Do đó có thể kết luận dòng nấm men CĐV1 thuộc nhóm 6 (dạng chuỗi) thuộc giống Geotrichum.
Kết quả định danh sơ bộ 27 dòng nấm men được thể hiện trong Bảng 13.
Bảng 13: Kết quả định danh sơ bộ 27 dòng nấm men dựa trên đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý Nhóm hình dạng nấm men
Đặc điểm hình thái Đặc điểm sinh lý
Định danh sơ bộ Hình dạng nấm men Tế bào nảy chồi Hình thành bào tử Lên men đƣờng Đồng hóa urea Glucose Saccharose
1 Cầu nhỏ Nhiều hướng 1-4 + + - Saccharomyces
2 Cầu lớn Nhiều hướng 1-4 + + - Saccharomyces
3 Oval Nhiều hướng 1-2 + + - Saccharomyces
4 Elip dài Lưỡng cực 1-4 - - + Pichia
5 Trụ Nhiều hướng 1-3 + + - Candida
6 Chuỗi Một cực 1-2 + - - Geotrichum
Như vậy, ở 2 địa điểm thu mẫu tỉnh Cần Thơ và tỉnh Đồng Tháp với điều kiện lên men tự nhiên (bổ sung và không bổ sung đường, vỏ) đã phân lập được 27 dòng nấm men, qua định danh sơ bộ 27 dòng nấm men này thuộc 3 giống nấm men và một ngành nấm men: giống Saccharomyces, giống Candida, giống Geotritchum và giống
Pichia.
4.2. Tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh
Ở thí nghiệm này chọn 14 dòng nấm men hình cầu và hình oval để tiến hành thí nghiệm: ĐĐV2, ĐĐV4, ĐĐV5, ĐKV1, ĐKK1, ĐKK2, ĐKK3, ĐKK4, CKV1, CKV2, CKK2, CKK3, CKK4, CKK5 và dòng đối chứng từ phòng thí nghiệm (dòng Mỹ).