3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xoài
Dịch xoài Bổ sung pectinase (Thí nghiệm 3)
Địa điểm (A1, A2)
Phối chế độ Brix (B1, B2) Phối chế độ Brix = 22 Phối chế độ Brix Phối chế pH = 4,2 (E1, E2, E3) Thành phần dịch quả (C1, C2) Phối chế pH
(F1, F2, F3) Lên men Thanh trùng bằng NaHSO3
Phân lập nấm men (140mg/l trong 2 giờ)
Nhân giống Chủng nấm men 106
tế bào/ml Chủng nấm men (trữ và sử dụng) (D1, D2, D3, D4, D5, D6, (G1, G2, G3)
D7, D8, D9, D10, D11, DT)
Thí nghiệm1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3
Hình 4. Sơ đồ quy trình tổng quát về phân lập nấm men từ dịch xoài 3.2.2. Phân lập và tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
a. Mục đích:
Phân lập, tách ròng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa chúng về dạng thuần khiết.
b. Cách tiến hành:
Tiến hành phân lập và tách ròng nấm men theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. - A: Thu mẫu giống xoài Cát Chu ở 2 địa điểm: A1: Đồng Tháp và A2: Cần Thơ, mỗi địa điểm thu một mẫu xoài với khối lượng từ 2-3kg.
- B: Lượng đường với 2 mức độ: B1: bổ sung đường đạt độ Brix = 22 và B2: không bổ sung đường (lên men tự nhiên).
thêm vỏ.
- Số bình lên men là 2 x 2 x 2 = 8
c. Cách tiến hành
- Xử lý nguyên liệu: Xoài được chia thành 2 phần: một phần rửa sạch, gọt vỏ thu lấy thịt xoài; một phần gọt vỏ cẩn thận thu lấy vỏ sau đó cắt nhỏ, bỏ hạt và thu lấy thịt xoài để riêng. Tiếp theo lấy phần thịt đem đi ép bằng thiết bị ép thu dịch quả.
- Phối chế: Dùng Brix kế để đo dộ Brix của dịch quả, ghi nhận lại kết quả vừa đo (Phụ lục 2, phần 2.1). Sau đó cho 100 ml dịch quả vào bình lên men có bổ sung thêm đường để đạt độ Brix theo yêu cầu thí nghiệm là Brix = 22 (Phụ lục 1) và không bổ sung thêm đường. Đối với nghiệm thức bổ sung vỏ thì ta bổ sung vào 50 gram/100 ml dịch quả.
- Lên men dịch quả: Đậy kín bình lên men bằng waterclock để quá trình lên men xảy ra tốt hơn.
- Sau 1-2 ngày quan sát quá trình lên men, khi quá trình xảy ra mạnh (quan sát số bọt khí xuất hiện trong bình lên men), tiến hành cấy dịch lên men lên đĩa petri bằng cách dùng micropipet lấy 0,1ml dịch lên men và nhỏ lên bề mặt đĩa môi trường đã được chuẩn bị (Phụ lục 2). Dùng que cấy gạt trãi đều dịch lên men lên bề mặt môi trường để tìm các giống nấm men.
- Công tác phân lập được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và các dụng cụ, môi trường phải được khử trùng. Sau khi cấy xong lật úp đĩa và đặt vào tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 37o
C trong 24-48 giờ, đem ra quan sát qua kính lúp, chọn những khuẩn lạc đứng tách biệt có màu sắc, hình dáng khác nhau, lấy để cấy chuyển mỗi loại vào từng đĩa petri có đánh số kí hiệu.
- Quan sát bằng kính lúp, nhận diện các khuẩn lạc đơn lẻ, trắng đục tiếp tục cấy chuyển như trên vài lần để đảm bảo độ thuần khiết của giống vừa phân lập. Xác định độ ròng của giống bằng cách quan sát hình dạng, màu sắc và đo kích thước của khuẩn lạc nấm men (dưới kính lúp), sau đó quan sát hình dạng và đo kích thước của tế bào nấm men dưới kính hiển vi.
Cấy truyền để bảo tồn giống vừa phân lập. Nhân giống trong ống nghiệm và trong bình tam giác để phát triển sinh khối dùng cho lên men và để trữ giống.
- Sơ đồ thí nghiệm:
Ép lấy dịch quả ở 2 địa điểm
A1: Đồng Tháp A2: Cần Thơ
Thêm đường Không thêm Thêm đường Không thêm
Thêm vỏ Không thêm vỏ
Lên men tự nhiên (1-2 ngày)
Cấy lên đĩa pêtri
Phân lập
Tách ròng và làm thuần
Kiểm tra độ thuần
Cấy truyền
Nhân giống trong ống nghiệm và bình tam giác Trữ ống trong tủ lạnh 4oC Sử dụng lên men
Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch xoài lên men.
d. Các chỉ tiêu theo dõi
- Số nấm men thuần phân lập được (tổng số 27 dòng).
- Hình dạng, màu sắc và kích thước của tế bào nấm men khi quan sát ở kính hiển vi.
- Hình dạng, kính thước, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc của nấm men. - Định danh sơ bộ các dòng nấm men phân lập dựa trên khoá phân loại. - Hình chụp các khuẩn lạc và tế bào nấm men.
3.2.3. Tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh
a. Mục đích:
Các chủng nấm men thuần khiết có sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng, khả năng tạo cồn và chịu cồn. Qua thí nghiệm này nhằm chọn ra nấm men thích hợp cho lên men rượu (hoạt lực lên men mạnh, nồng độ cồn cao).
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là nấm men phân lập được. Trong 27 dòng nấm men phân lập được từ thí nghiệm phân lập, chọn 14 dòng nấm men và sử dụng dòng Mỹ làm dòng nấm men đối chứng, với cùng 1 mức độ/mật số chủng 106 tế bào/ml dịch lên men và 2 lần lặp lại.
Số nghiệm thức là 15 nghiệm thức x 2 lần lặp lại = 30 đơn vị thí nghiệm. (Bố trí thí nghiệm song song trong chai Durham và trong bình tam giác).
c. Cách tiến hành: - Sơ đồ thí nghiệm: 100ml dịch quả Điều chỉnh pH = 4,2; độ Brix = 22o
Thanh trùng bằng NaHSO3 trong 30 phút
Chủng các giống nấm men (106 tế bào/ml)
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7
Lên men
Khảo sát tốc độ lên men (lượng CO2 sinh ra)
Lắng lọc
Phân tích các chỉ tiêu (đo pH, độ đường, độ cồn)
Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men cao.
Sử dụng chai Durham (cấu tạo gồm: chai thuỷ tinh có nắp đậy và ống thuỷ tinh úp ngược) để khảo sát sự lên men của các dòng nấm men.
Chuẩn bị dịch nấm men: Nuôi nấm men thuần vừa phân lập trong môi trường nhưng không có agar ở 30oC, trong 24 giờ. Nấm men thuần dùng trong phòng thí nghiệm: hồi sinh nấm men khô trong nước cất, ủ trong 30 phút. Tiến hành đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (Phụ lục 1, phần 1.3).
Cho 100ml dịch quả đã điều chỉnh về pH = 4,2 và độ Brix = 22o vào mỗi bình tam giác thanh trùng bằng NaHSO3 140 mg/l trong 30 phút. Sau đó chủng các dòng nấm men cần khảo sát vào, với mật số 106
tế bào/ml (100ml dịch quả + 1 ml dịch giống nấm men). Khuấy trộn cho nấm men phân tán đều trong các bình lên men. Dùng bông gòn đậy kín các bình lên men để quá trình lên men xảy ra ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Quan sát quá trình lên men và tiến hành phân tích các chỉ tiêu khi kết thúc quá trình lên men (quan sát thấy hết sủi bọt khí).
Bố trí thí nghiệm trong chai Durham song song với bố trí thí nghiệm trong bình tam giác. Cho 9 ml dịch quả lên men như trên vào chai Durham. Sau đó cho 1ml dung dịch các dòng nấm men (với mật số 106
tế bào/ml) cần khảo sát, ủ ở nhiệt độ phòng (28-30oC) quan sát và ghi nhận thời gian làm đầy ống Durham bởi CO2 của các dòng nấm men. Dòng nấm men nào làm đầy ống Durham sớm nhất thì biểu hiện cường độ lên men mạnh nhất.
d. Các chỉ tiêu theo dõi
- Cột khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men (theo phương pháp quan sát chiều cao của cột khí do CO2 sinh ra).
- Lượng đường trước và sau khi lên men (sử dụng Brix kế để đo). - Lượng cồn sinh ra sau khi lên men bằng phương pháp chưng cất. - pH trước và sau khi lên men (bằng pH kế).
Kết hợp cột khí CO2 quan sát ở chai Durham và các tiêu chí theo dõi ở quá trình lên men trong bình tam giác để chọn ra nấm men có cường độ lên men tốt nhất.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên quá trình lên men rƣợu
a. Mục đích:
Sử dụng dòng nấm men Saccharomyces (CKV1) có hoạt lực lên men mạnh được tuyển chọn từ thí nghiệm tuyển chọn một số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh để tìm ra tỉ lệ nấm men, độ Brix, độ pH thích hợp nhất cho quá trình lên men.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số với 3 nhân tố, 3 mức độ và 2 lần lặp lại.
Nhân tố E: Độ Brix vớ 3 mức độ: E1= 19 E2 = 23 E3 = 27
Nhân tố F: Độ pH với 3 mức độ: F1 = 3,5 F2 = 4,0 F3 = 4,5
Nhân tố G: tỷ lệ nấm men trong dịch lên men với 3 mức độ: G1 = 103 tế bào/ml G2 = 105 tế bào/ml G3 = 107 tế bào/ml
Tống số nghiệm thức là 3 x 3 x 3 = 27, số đơn vị thí nghiệm là 27 x 2 = 54
Bảng 8: Tổng số nghiệm thức của thí nghiệm
E F G G1 G2 G3 E1 F1 F2 F3 E1F1G1 E1F2G1 E1F3G1 E1F1G2 E1F2G2 E1F3G2 E1F1G3 E1F2G3 E1F3G3 E2 F1 F2 F3 E2F1G1 E2F2G1 E2F3G1 E2F1G2 E2F2G2 E2F3G2 E2F1G3 E2F2G3 E2F3G3 E3 F1 F2 F3 E3F1G1 E3F2G1 E3F3G1 E3F1G2 E3F2G2 E3F3G2 E3F1G3 E3F2G3 E3F3G3 c. Tiến hành thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm: 100ml dịch xoài Độ Brix Độ pH Tỷ lệ nấm men 19o 23o 27o 3,5 4,0 4,5 103 105 107 Lên men Lắng lọc Phân tích tìm ra giá trị pH, độ Brix, tỉ lệ nấm men tối ưu.
Hình 7. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các nhân tố nồng độ nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên quá trình lên men rƣợu
Thu nhận dịch xoài: Lựa chọn xoài Cát Chu chín, ngon, không bị hư hỏng. Rửa sạch, loại bỏ vỏ và hạt rồi đem đi xay nhỏ (bổ sung nước với tỷ lệ 1:1). Tiếp theo bổ sung enzyme pectinase vào dịch quả là 0,15% và thời gian thủy phân 20 phút (Nguyễn Nhật Minh Phương et al., 2011). Sau đó, tiến hành lọc để thu dịch xoài.
sau đó điều chỉnh độ Brix bằng cách bổ sung đường và điều chỉnh pH bằng cách cho vào acid citric theo các giá trị như bảng bố trí thí nghiệm. Thanh trùng bằng NaHSO3 trong 30 phút và sau đó chủng nấm men (nhân tố F) vào một cách ngẫu nhiên theo bố trí thí nghiệm. Lên men 11 ngày ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (28-30oC). Sau khi lên men xong thì lắng lọc và thu lấy sản phẩm đem đi phân tích các chỉ tiêu.
d. Các chỉ tiêu theo dõi:
-pH trước và sau lên men bằng pH kế
-Nồng độ đường sau lên men đo bằng Brix kế
-Độ rượu tạo ra sau khi lên men đo bằng phương pháp chưng cất
Sau khi đánh giá tất cả các chỉ tiêu ta chọn ra nghiệm thức tối ưu về độ Brix, pH và mật số nấm men thích hợp nhất để lên men rượu vang.
Từ kết quả TN, sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XV thiết lập quy trình hồi quy vẽ biểu đồ mặt đáp ứng tính toán ra các thông số tối ưu về mật số nấm men, độ Brix, giá trị pH.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
4.1.1. Kết quả phân lập nấm men
Sau quá trình phân lập thu được 27 dòng nấm men thuần ở 2 địa điểm: Đồng Tháp và Cần Thơ.
a. Địa điểm thu mẫu Cần Thơ
Tại Cần Thơ phân lập được tổng cộng có 16 dòng gồm 7 dòng ở điều kiện có bổ sung đường và vỏ, 2 dòng ở điều kiện bổ sung đường và không vỏ, 2 dòng ở điều kiện không bổ sung đường và có vỏ, 5 dòng ở điều kiện không bổ sung đường và không vỏ. Hình thái các dòng nấm men phân lập gồm hình cầu nhỏ, hình cầu lớn, hình oval, hình elip dài và dạng chuỗi (Bảng 9).
(1) CKV2 (2) CKK2 (3) CĐV1 (4) CĐK2 (5) ĐĐV4 (6) ĐĐV1 (7) ĐKV1 (8) ĐKK1
Hình 8: Hình dạng một số dòng nấm men phân lập đƣợc tại Cần Thơ và Đồng Tháp (Hình chụp ở vật kính 100)
b. Địa điểm thu mẫu Đồng Tháp
Tại Đồng Tháp phân lập được 11 dòng, gồm 5 dòng ở điều kiện có bổ sung đường và vỏ, 2 dòng ở điều kiện không bổ sung đường và có vỏ, 4 dòng ở điều kiện
không bổ sung đường và không vỏ, ở điều kiện bổ sung đường và không vỏ không phân lập được dòng nấm men nào. Hình thái các dòng nấm men phân lập gồm hình cầu nhỏ, hình cầu lớn, hình oval và hình trụ (Bảng 9).
Bảng 9: Tổng hợp các đặc điểm hình thái các dòng nấm men phân lập đƣợc
Hình dạng tế bào Dòng nấm men Kích thƣớc tế bào (µm) Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình cầu nhỏ CKV1 CĐV6 CKV2 CKK5 ĐĐV4 ĐKV2 ĐKK3 ĐKK4 2,80 x 3,45 3,02 x 4,09 3,52 x 4,76 3,53 x 4,79 3,50 x 4,12 4,09 x 4,58 2,88 x 4,09 3,25 x 4,56 2,5-3,5 4-5 2-3 3-4 3-4 3-4 1-2 4-5
Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nhăn Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Nhỏ tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nhăn
Hình cầu lớn CĐV7 CKK2 CKK3 CKK4 ĐĐV2 ĐĐV5 ĐKV1 3,18 x 3,61 3,46 x 4,81 3,38 x 4,65 3,38 x 3,89 3,14 x 4,04 2,57 x 4,05 3,24 x 3,71 3-4 1,5-2,5 4-5 3,5-4,5 2,5-3 4-5 1-2
Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên Nhỏ tròn, trắng kem, bề mặt trơn láng, bìa nguyên To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Nhỏ tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Hình oval CĐV4 CĐV5 CKK1 ĐKK1 ĐKK2 ĐĐV3 2,67 x 3,18 3,41 x 5,19 3,48 x 4,87 4,12 x 3,21 3,70 x 4,92 3,24 x 4,28 2,5-3,5 2,5-3,5 4-5 5,5-6,5 2,5-3,5 3-4
Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nhăn Tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Hình elip dài CĐK1 CĐK CĐV2 CĐV3 3,75 x 6,8 1,72 x 4,05 3,26 x 4,73 2,02 x 4,38 4-5 3-4 1-2 3,5-4,5
To tròn, cam đỏ, bề mặt trơn láng, bìa nhăn To tròn, cam nhạt, bề mặt trơn láng, bìa nguyên Nhỏ tròn, trắng kem, bề mặt trơn láng, bìa nguyên Tròn, trắng kem, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Hình trụ ĐĐV1 3,10 x 7,17 3,5-5 To tròn, trắng đục, bề mặt trơn láng, bìa nguyên
Dạng chuỗi CĐV1 3,63 x 3,88 7-8 To tròn, trắng kem, bề mặt khô, bìa nhăn
Từ kết quả phân lập tại 2 địa điểm Cần Thơ và Đồng Tháp cho thấy phân lập được đa số là nấm men hình cầu và hình oval. Nấm men hình chuỗi và hình elip chỉ
xuất hiện ở mẫu xoài Cần Thơ lên men tự nhiên. Nấm men hình trụ chỉ xuất hiện ở mẫu xoài Đồng Tháp lên men tự nhiên. Điều này cho thấy có sự phân bố đa dạng về hình thái nấm men đối với từng vùng sinh thái khác nhau.
Bảng 10: Tổng hợp số dòng nấm men phân lập ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
Điều kiện nuôi cấy Số dòng nấm men
Địa điểm Cần Thơ Địa điểm Đồng Tháp
Có đường, có vỏ 7 5
Có đường, không vỏ 2 2
Không đường, có vỏ 2 0
Không đường, không vỏ 5 4
Tổng cộng: 16 11
Đối với mẫu xoài lên men ở các điều kiện khác nhau (có đường và không đường, có vỏ và không vỏ) trên môi trường PGA không có khác biệt lớn về hình dạng và kích thước tế bào nấm men trong từng nhóm nấm men. Nhưng về khuẩn lạc thì có sự khác biệt giữa 2 địa điểm thu mẫu này và giữa những nấm men cùng một địa điểm thu mẫu. Ví dụ, cùng một dạng hình cầu nhỏ thì có sự khác biệt về kích thước khuẩn lạc, dạng bìa, màu sắc. Điều này phù hợp với tài liệu của Lương Đức Phẩm (2009) cho rằng hình thái và kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men phụ thuộc vào mức độ phát triển,