Quá trình lên men chia thành 3 thời kì chính. Thời kì đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên
men không đáng kể. Thời kì sau: Đây là thời kì lên men chính, chiếm khoảng từ 60- 120 giờ sau thời kì đầu. Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt trị số cực đại. Thời kì cuối: Đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kì ổn định tạo mùi cho sản phẩm.
Glucose Hexokinaza Glucose – 6 – phosphat Photphoglucoza isomeraza Fructose – 6 – phosphat PhosphoFructokinaza Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza
Glyceraldehyd – 3 – phosphat Dihydro aceton phosphat
Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinaza Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerat-mutaza Acid – 2 – phosphoglyceric Enoiaza Acid phosphoenolpyruvic Pyruvat kinaza Acid – enol – pyruvic
Acid pyruvic
Pyruvate – decarboxylaza Ethanal
Aldodeshydrogenaza Ethanol
Hình 2. Cơ chế của quá trình lên men
(* Nguồn: Đồng Thị Thanh Thu, 1995).
Thời kì lên men chính là thời kì biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Trong giai đoạn này, trong
điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi khoảng 1 độ (Brix, balling, %) tuỳ loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất. Sự tồn tại của thời kì lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch đường hoá từ nguyên liệu chứa tinh bột.
Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường tồn tại trong dịch lên men là 100% thì 4-6% là dạng chất không tan, 75-77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin. Trong giai đoạn lên men sự đường hoá cũng xảy ra rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó với tinh bột không hoà tan (Nguyễn Công Hà, 2000).
2.5.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 2.5.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Theo Bùi Ái (2003) và Casellas (2005), nhiệt độ đóng vai trò quan trọng đến hiệu suất lên men rượu. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt động trao đổi chất của nấm men. Nấm men rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, ở 36oC nấm men bắt đầu bị ức chế, tỉ lệ chết cao ở nấm men có thể dẫn đến kết quả lên men thấp, nhiệt độ tối ưu cho nấm men rượu vang là 25-28oC. Nhiệt độ thấp hơn 16oC nấm men hoạt động chậm và yếu, vì vậy lượng đường còn lại trong môi trường lên men khá lớn và đây là môi trường tốt cho những vi sinh vật gây bệnh rượu vang hoạt động.
Nhiệt độ lên men càng thấp, thời gian lên men càng dài, hiệu suất chuyển hoá đường thành rượu cao, chất lượng rượu vang khi đó tốt hơn, hương thơm tạo thành khi đó sẽ khuếch tán vào trong dung dịch. Ngoài ra, ở nhiệt độ thấp số lượng tối đa của tế bào nấm men vẫn duy trì không đổi suốt quá trình lên men rượu. Nhiệt độ càng cao, lên men càng hạn chế, độ rượu càng thấp, lượng đường còn lại trong rượu càng nhiều, nhiệt độ đường cao có thể gây ra sự ngừng quá trình lên men.
2.5.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH = 2-8 nhưng thích hợp nhất là 4-4,5, vi khuẩn bắt đầu phát triển tốt ở pH = 4,2 và cao hơn. Vì vậy trong lên men rượu, để ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8-4. Tuy nhiên, trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng chất sát trùng. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển.
Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của nấm men (Nguyễn Công Hà, 2000).
2.5.4.3. Ảnh hƣởng của Oxy
Hầu hết các dòng nấm men trong lên men rượu vang thuộc dòng nấm men
Saccharomyces. Chúng là các vi sinh vật kị khí không bắt buộc. Môi trường đủ lượng nấm men phân huỷ đường dùng làm nguồn năng lượng cấu tạo tế bào và tăng sinh khối. Trường hợp thiếu oxy hoặc không có oxy, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kị khí. Khi đó sản phẩm trong môi trường lên men chủ yếu là rượu ethylic.
Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu có oxy để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối. Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.5.4.4. Ảnh hƣởng của đƣờng
Nếu nồng độ của đường quá cao sẽ dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Kết quả là rượu hình thành sẽ ức chế tạp chất và cả nồng độ dịch đường cũng tạo điều kiện cho lên men vi khuẩn phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Bình thường dịch lên men thường có nồng độ chất khô 16-18%, tương đương với 13-15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường lên men lactic (Trần Minh Tâm, 2000).
2.5.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ rƣợu ethylic
Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kị khí là rượu ethylic. Rượu ethylic sẽ ức chế hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ ức chế khác nhau đối với các dòng nấm men khác nhau. Khả năng chịu đựng rượu ethylic của nấm mốc, vi khuẩn còn kém hơn nhiều so với nấm men. Điều này thực sự có ý nghĩa lớn trong sản xuất, bởi vì quá trình lên men kị khí bắt đầu xảy ra thì những sản phẩm ethylic hình thành trong môi trường có tác dụng ức chế mạnh mẽ nấm mốc, vi khuẩn (Bùi Ái, 2003).
2.5.4.6. Thời gian lên men
Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nhiệt độ lên men, nồng độ đường dịch lên men, dòng nấm men. Quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men tính từ lúc cấy giống vào môi trường lên men. Sự lên men thật
sự kết thúc khi nấm men hết khả năng chuyển hoá đường thành rượu và CO2. Càng về cuối giai đoạn lên men, bọt khí sinh ra ít hơn và nhỏ dần đi, tốc độ lưu chuyển của chúng cũng giảm theo.
Kết thúc quá trình lên men chính, nồng độ đường giảm đáng kể, bọt khí rất chậm và ít. Thực tế, biểu hiện kết thúc quá trình lên men phụ khó nhận ra vì khí CO2 lúc này không còn khả năng tạo bọt nổi lên trên mà khuếch tán ngay vào rượu. Chính vì vậy thời gian tàng trữ rượu từ 3 tháng trở lên rượu mới có giá trị cảm quan cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở nhiệt độ trung bình từ 25-30oC nếu pH khác nhau thì thời gian lên men khác nhau, nhiệt độ này thích hợp cho nấm men phát triển, thời gian lên men kéo dài từ 15- 20 ngày. Ở nhiệt độ cao 50-60oC, quá trình lên men bị dừng, tế bào nấm men chết dần (Trần Minh Tâm, 2000).
2.6. Tình hình sản xuất rƣợu vang 2.6.1. Trên thế giới 2.6.1. Trên thế giới
Rượu vang rất được ưu chuộng trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Âu. Theo thống kê hàng năm Ý và Pháp thường có lượng sản xuất rượu vang đứng đầu trên thế giới.
Bảng 7: Sản xuất rƣợu vang trên thế giới năm 2007
Hạng Quốc gia Sản lƣợng (tấn) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Italy France Spain United States Argentina China South Africa Australia Germany Chile 5.050.000 4.711.600 3.645.000 2.300.000 1.550.000 1.450.000 1.050.000 961.972 891.600 827.746
(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Wine ngày 22/7/2013)
Theo Hồ Thanh Trúc (2010), tình hình một số loại rượu vang nổi tiếng trên thế giới như sau:
+ Rƣợu vang Pháp
Vùng Alsace, nổi tiếng về rượu vang trắng. Sản lượng rượu vang trắng của Alsace chiếm 30% tổng sản lượng rượu vang trắng của Pháp. Rượu vang trắng ở đây có tên gọi duy nhất là Vang Alsace.
không có các vườn nho cỡ lớn mà chỉ có những vườn nho thuộc diện gia đình, diện tích chỉ khoảng 50 ha nhưng lại có đến 56 ông chủ vườn. Phần đông các chủ vườn đều bán nho cho các tiệm rượu để họ pha chế và bán ra thị trường.
Vùng Bordeaux, sản xuất rượu vang nổi tiếng và quan trọng của Bordeaux là: Médoc, Haut Médoc, Graves Barsac, Sauternes, St Emilion, Pomerol, Cérons, Loupiac, Pronsac, Bourg.
Vùng Champagne, sản xuất rượu vang tinh tế, quí tộc mà không nơi nào trên thế giới bì kịp. Nhờ vào giống nho, điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nhất là kĩ thuật sản xuất và kinh nghiệm nên nước Pháp đã sản xuất loại rượu vang đặc biệt này. Phần lớn rượu Champagne được sản xuất từ giống nho đỏ thẫm Pinot Noir có chất đường, nước trắng nên độ rượu mạnh và giống như Chardonnay có màu vàng kim, đem lại vị thanh cao và hương thơm.
+ Rƣợu vang Mỹ
Rượu vang thương phẩm (Branded Wine).
Rượu vang thông dụng (Generic Wine) như: Vang California Burgundy. Rượu vang pha trộn (Blended Wine), trên nhãn ghi American Wine. + Rƣợu vang Đức
Rượu vang bàn (Deutcher Tafewein). Rượu vang vùng (Landwein).
Rượu vang Qualitatswein bestimmter Anbuagebiete (QbA).
Rượu vang Qualitatswein mit Pradikat: là loại rượu vang chất lượng cao (QmP).
2.6.2. Tại Việt Nam
Theo Hồ Thanh Trúc (2010), ở nước ta hiện nay có vài công ty sản xuất rượu vang nổi tiếng như:
+ Rượu vang Đà Lạt (Công ty Ladofoods). + Công ty liên doanh Việt - Đức (Van - Gres).
+ Vang Thanh Long, vang Thành Long, vang Viết Nghi.
- Những khó khăn trong sản xuất rƣợu vang ở nƣớc ta:
+ Nho vùng nhiệt đới không cho sản phẩm rượu chất lượng cao.
+ Thị trường tiêu thụ chưa mạnh.
+ Thuế rượu nhập khẩu có xu hướng ngày càng giảm. - Tiềm năng phát triển
+ Việt Nam là một quốc gia đông dân vì thế sức tiêu thụ rất lớn.
+ Việt Nam không lạ lẫm với rượu vang bởi ảnh hưởng khá đậm nét của văn hoá Châu Âu, Châu Mỹ, nhất là văn hoá Pháp.
+ Việt Nam đang là nước rất có tiềm năng trong thu hút khách du lịch quốc tế.
2.6.3. Một số nghiên cứu rƣợu vang trong nƣớc - Rƣợu vang thanh long (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đề tài Khảo sát ảnh hưởng của một số chủng nấm men trong sản xuất rượu vang thanh long (Đàm Sao Mai et al., 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện cho sản phẩm rượu thích hợp nhất khi sử dụng phối hợp 50% nấm men Saccharomyces ovitomis, 50% nấm men Saccharomyces vini, độ Brix ban đầu là 23,7. Sản phẩm rượu vang thanh long thu nhận đạt được hàm lượng ethanol (độ cồn) là 12%v/v, pH là 3,48; độ Brix là 6,27.
- Rƣợu vang sơ ri
Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu sơ ri (Trần Thị Thuỳ Trang, 2003). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là sơ ri, được thực hiện 15 tuần và cho ra những kết quả như sau: pH thích hợp lên men là 4,3; độ Brix là 22, thời gian kết thúc quá trình lên men là 14 ngày.
- Rƣợu vang mía
Đề tài Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang mía (Lý Huỳnh Liên Hương et al., 2009). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là nước mía, được thực hiện 6 tháng và cho ra những kết quả như sau: Nguồn nấm men sử dụng là nấm men thị trường với mật số là 106
tế bào/ml, thanh trùng nguyên liêu bằng NaHSO3 140 mg/l trong 30 phút, độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4, thời gian lên men là 5 ngày ở 30oC.
- Rƣợu vang bƣởi
Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu vang bưởi da xanh (Mai Thị Tươi, 2007). Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là bưởi da xanh, được thực hiện trong 3 tháng và cho ra những kết quả như sau: Tỉ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình lên men rượu là 1: 0,5
(1 lít dịch quả thêm vào 0,5 lít nước, độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4,2; thời gian lên men là 8 ngày.
- Rƣợu vang chuối Xiêm
Đề tài Ứng dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối (Trần Ngọc Điệp, 2008). Đề tài có thể sử dụng nguồn nguyên liệu là chuối Xiêm, thời gian thực hiện là 12 tháng và cho những kết quả như sau: Việc sử dụng chế phẩm pectinase ở nồng độ 0,02% và chitosan ở nồng độ 0,01% cho sản phẩm có độ trong tốt. Tuy nhiên, sử dụng chitosan cho sản phẩm rượu trong hơn so với việc sử dụng pectinase. Thời gian lên men phụ ít nhất là 2 tháng và nhiệt độ lên men thích hợp là 10oC.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện – vật liệu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Thời gian thực hiện 20 tuần (từ tháng 6/2013 đến tháng 11/2013).
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Xoài được mua ngoài thị trường ở 2 địa điểm: Đồng Tháp, Cần Thơ thuộc giống xoài Cát Chu. Bởi giống xoài này hiện được trồng phổ biến, có giá trị kinh tế cao và chất lượng đứng thứ hai (chỉ sau giống xoài Cát Hòa Lộc) trong các giống xoài hiện nay. Xoài dùng cho các thí nghiệm được chọn là những trái xoài có độ chín vừa phải, màu sắc vàng tươi, cuống quả còn mới, không có nhiều vết đen, độ Brix đạt từ 14-15.
Hình 3. Độ chín quả xoài đƣợc chọn để tiến hành các thí nghiệm
Nấm men Saccharomyces cerevisiae (dòng Mỹ) từ trường Đại học Uc-Davis, Hoa Kỳ được bảo quản ở 4oC tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và dòng nấm men vừa phân lập từ lên men dịch quả xoài.
Khoai tây, agar, đường Biên Hòa mua ngoài thị trường.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ cần thiết dùng cho phòng thí nghiệm: - Kính hiển vi (Olympus BH2, BX41TF, made in Japan). - Buồng đếm hồng cầu, lame đếm.
- Máy đo pH với độ chính xác 0,01 (TichoLine Schott, made in Germany). - Cân điện tử với độ chính xác 0,01g (Sartorius, made in Germany).
- Chiết quang kế (hiệu ATA GG.N-1E, Brix 0-32%, made in Japan). - Dụng cụ chưng cất, cồn kế (made in Germany).
- Máy ép nguyên liệu (Panasonic, made in Japan).
- Tủ cấy vô trùng (Esco, made in Singapore), tủ ủ vi sinh (Sanyo, made in, Japan), tủ lạnh (made in Japan).
- Dụng cụ để phân lập nấm men: đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn,…
- Bộ tỉ trọng Hydrometer, micropipet, bình lên men, bình tam giác và một số dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm.
3.1.4. Hoá chất sử dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hoá chất thanh trùng: NaHSO3. - Hoá chất thay đổi pH: NaHCO3.
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường PGA (khoai tây-đường-agar) và môi trường PGY (khoai tây-đường-yeast extract) có bổ sung khoáng (Phụ lục 1, phần 1.2).
3.2. Nội dung và bố trí thí nghiệm 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xoài
Dịch xoài Bổ sung pectinase (Thí nghiệm 3)
Địa điểm (A1, A2)
Phối chế độ Brix (B1, B2) Phối chế độ Brix = 22 Phối chế độ Brix Phối chế pH = 4,2 (E1, E2, E3) Thành phần dịch quả (C1, C2) Phối chế pH
(F1, F2, F3) Lên men Thanh trùng bằng NaHSO3
Phân lập nấm men (140mg/l trong 2 giờ)
Nhân giống Chủng nấm men 106
tế bào/ml Chủng nấm men (trữ và sử dụng) (D1, D2, D3, D4, D5, D6, (G1, G2, G3)
D7, D8, D9, D10, D11, DT)
Thí nghiệm1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3
Hình 4. Sơ đồ quy trình tổng quát về phân lập nấm men từ dịch xoài 3.2.2. Phân lập và tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
a. Mục đích:
Phân lập, tách ròng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa chúng về dạng thuần khiết.
b. Cách tiến hành:
Tiến hành phân lập và tách ròng nấm men theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. - A: Thu mẫu giống xoài Cát Chu ở 2 địa điểm: A1: Đồng Tháp và A2: Cần Thơ, mỗi địa điểm thu một mẫu xoài với khối lượng từ 2-3kg.
- B: Lượng đường với 2 mức độ: B1: bổ sung đường đạt độ Brix = 22 và B2: không bổ sung đường (lên men tự nhiên).