2.2.1. Bố trí thí nghiệm
2.2.1.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thể hiện trên Hình 2.3. Theo đó, dịch chiết thô thu được từ lá vối sẽđược tinh sạch một phần trước khi ứng dụng xử lý ngâm
các miếng cá nục phi lê. Sự biến đổi chất lượng của các miếng cá nục phi lê sẽđược theo dõi theo thời gian bảo quản. Sử dụng các chỉ tiêu hóa học đểđánh giá mức độ oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục theo thời gian bảo quản. Dữ liệu thu được sẽđược xử lý, phân tích đểđi đến kết luận về khả năng hạn chế sựoxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục bằng dịch chiết từ lá vối.
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.
2.2.1.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận dịch chiết từ lá vối
Hình 2.4 trình bày sơ đồ bố trí thí nghiệm để thu nhận dịch chiết từ lá vối. Nguyên liệu lá vối được thu hái và xử lý như được trình bày trong Mục 2.1.1. Các nhân tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết bao gồm: Nồng độ dung môi ethanol, tỉ lệ
Nguyên liệu lá vối Chiết Dịch chiết thô Tinh sạch Dịch chiết Xử lý ngâm cá nục Bao gói Bảo quản
Theo dõi sự biến đổi chất lượng
Kết luận Cá nục nguyên con
Xử lý phi lê
dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết được nghiên cứu. Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoặc yếu tố từng phần, có nghĩa là để nghiên cứu ảnh hưởng của một nhân tốnào đó thì cố định các nhân tố khác và cho nhân tố cần nghiên cứu thay đổi. Sau khi tìm được thông số thích hợp, cố định thông sốđó để nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố còn lại.
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhân tố nồng độ dung môi thì các thông số cố định gồm: Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (30/1, ml/g), nhiệt độ 60oC và thời gian 60 phút. Nồng độ ethanol chạy từ 0 – 100%, bước nhảy 20%.
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thì các nhân tố cốđịnh gồm: Nồng độ dung môi, nhiệt độ 60oC, thời gian 60 phút, tỉ lệ chạy từ 20/1 – 70/1 (ml/g), bước nhảy 10.
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thì các nhân tố cố định gồm: Nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian chiết 60 phút, nhiệt độdao động từ 30 - 80 oC, bước nhảy 10 oC.
Cuối cùng nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết thì các nhân tố cố định gồm: Nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ. Thời gian dao động từ 20 đến 120 phút, bước nhảy 20 phút.
Trong tất cả các quá trình chiết, bã rắn được chiết lại hai lần (dựa vào kết quả nghiên cứu thăm dò trước đây).
Dịch chiết thô thu được chiết qua các phân đoạn sử dụng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm: Chloroform, Hexane, Ethyl acetate, n-butanol và nước. Hiệu suất thu hồi dịch chiết, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các phần chiết được xác định. Phần chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu thu nhận dịch chiết từ lá vối.
2.2.1.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê nục phi lê
Quy trình xử lý ngâm các miếng các nục phi lê bằng dịch chiết từ lá vối được thực hiện theo Hình 2.5. Các miếng cá nục phi lê được xử lý ngâm trong dịch chiết lá vối ở hai nồng độ 200 ppm và 400 ppm, tỉ lệ nguyên liệu/dịch chiết là 1/4 (g/ml), thời gian ngâm là 45 phút, nhiệt độ ngâm khoảng 10oC. Mẫu đối chứng cũng được
Nguyên liệu lá vối Làm khô Nghiền thành bột Chiết Lọc Dịch chiết thô
Chiết qua các phân đoạn
Phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất Thu nhận Bảo quản Ứng dụng Bã 2 lần
thực hiện trong điều kiện tương tự, ngoại trừ thay dịch chiết bằng nước cất. Bên cạnh đó, mẫu đối chứng dương sử dụng dụng chất chống oxy hóa thương mại Vitamin C ở nồng độ 200 ppm cũng được tiến hành trong điều kiện tương tự. Các miếng cá sau khi xử lý ngâm dịch chiết xong được để ráo 10 phút, được làm khô đến độẩm khoảng 12%, sau đó được bao gói trong túi PE và được bảo quản ở hai điều kiện nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (50C). Sự biến đối chất lượng của thịt cá, sự oxy hóa lipid trong cơ thịt được đánh giá theo thời gian bảo quản. Dựa vào dữ liệu thu thập được, tiến hành phân tích để đánh giá được hiệu quả hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết lá vối.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê.
2.2.2. Các phương pháp phân tích
2.2.2.1. Xác định thành phần hóa học cơ bản
Hàm lượng ẩm của cơ thịt cá nục được xác định theo phương pháp cân khối lượng như được mô tả trong AOAC (1995). Tóm tắt: Cân khoảng 5 g thịt cá được xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, sự chênh lệch khối lượng thịt cá trước và sau khi sấy chính là lượng ẩm có trong cơ thịt cá. Từ đó xác
Rửa Phi lê Rửa Xử lý ngâm Dịch chiết 200 ppm Để ráo Làm khô Bao gói Dịch chiết 400 ppm Nước cất Vitamin C 200 ppm Bảo quản Nhiệt độ phòng
Theo dõi biến đổi chất lượng Thu thập dữ liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
định được tỉ lệ phần trăm ẩm trong nguyên liệu. Phương pháp trên cũng được áp dụng để xác định hàm lượng ẩm trong miếng cá nục sau làm khô và hàm ẩm trong nguyên liệu lá vối sau làm khô.
Hàm lượng tro được xác đinh theo phương pháp của AOAC (1995). Cụ thể: Cân khoảng 3 g thịt cá được tro hóa ở nhiệt độ 560 oC trong 24 giờ, phần khối lượng còn lại sau tro hóa chính là lượng tro có trong nguyên liệu. Kết quả được báo cáo dưới dạng phần trăm so với nguyên liệu ban đầu.
Hàm lượng protein trong cơ thịt cá nục được xác định theo phương pháp Kjendahl. Tóm tắt: Mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa. Cacbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, trong khi đó Nitơ tạo thành dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 để chuyển về dạng (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO40,1N. Định lượng H2SO4 0,1N dư còn lại bằng NaOH 0,1N chuẩn. Từ đó xác định được lượng Nitơ có trong mẫu, nhân với hệ số chuyển đổi 6,25 sẽ xác định được hàm lượng protein có trong mẫu.
Hàm lượng lipid trong thịt cá nục được xác định theo phương pháp của Bligh và Dyer (1957) với một vài thay đổi nhỏ. Tóm tắt: Cân một lượng mẫu xác định (10g) được chiết với hỗn hợp dung môi chloroform: methanol (2/1, v/v) với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/6 (g/ml). Hỗ hợp được đồng hóa trong 15 phút trước khi để qua đêm ở điều kiện lạnh. Sau đó, lọc để thu dịch lọc, cho thêm 10 ml KCl 0,88%, hỗn hợp được trộn đều trong 5 phút bằng vortex ở tốc độ 3. Hỗn hợp được để lạnh trong vài giờđồng hồđể sự tách lớp rõ ràng và triệt để. Thu lớp bên dưới, bay hơi đuổi dung môi ởđiều kiện áp suất giảm (máy cô quay chân không) để thu được lượng lipid. Từđó tính được hàm lượng lipid (%) có trong nguyên liệu.
2.2.2.2. Xác định hiệu suất thu hồi dịch chiết từ lá Vối
Hiệu suất thu hồi dịch chiết từ lá Vối được xác định bằng phương pháp cân khối lượng. Hiệu suất được xác định bằng khối lượng dịch chiết thu được so với nguyên liệu ban đầu, kết quảtính toán dưới dạng phần trăm theo công thức sau:
100 (%)
M m HS
Trong đó: HS là hiệu suất thu dịch chiết (%), m là khối lượng dịch chiết thu được, M khối lượng nguyên liệu ban đầu.
Công thức trên cũng được áp dụng để tính hiệu suất thu hồi dịch chiết từ các phân đoạn chiết.
2.2.2.3. Xác định sự có mặt của các nhóm hợp chất có trong dịch chiết thô
Sự có mặt của các nhóm hợp chất có trong dịch chiết thô từ lá vối được nhận diện bằng các phép thử định tính theo phương pháp được mô tả bởi Yadav và Agarwala (2011).
Phát hiện sự có mặt của nhóm chất phenol và tannins: 1 ml dịch chiết (25 mg/ml) được trộn với 2 ml của FeCl3 2%. Màu xanh nước biển xuất hiện chỉ ra sự có mặt của phenol và tannins.
Phát hiện sự có mặt của nhóm chất flavonoid bằng phép thử với AlCl3. Tóm tắt: Nhỏ vài giọt AlCl3 1% vào trong ống nghiệm chứa 4 ml dịch chiết (25 mg/ml). Nếu màu vàng xuất hiện chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid, màu càng đậm hàm lượng càng cao.
Phát hiện sự có mặt của nhóm chất alkaloids bằng thuốc thử Mayer’s và Waner. Tóm tắt: 1 ml dịch chiết (25 mg/ml) được trộn với 2 ml HCl 1% và đung nóng nhẹ. Sau đó thêm thuốc thử Mayer’s và Waner vào. Quan sát thấy kết tủa đục xuất hiện chứng tỏ có mặt của alkaloids.
Phát hiện sự có mặt của nhóm chất steroid: 1 ml của dịch chiết (25mg/ml) được trộn với 2 ml chloroform và thêm từ từ H2SO4đậm đặc được thêm vào hỗn hợp, sự xuất hiện của màu đỏở lớp chloroform bên dưới chỉ ra sự có mặt của steroids.
2.2.2.4. Định lượng polyphenol có trong dịch chiết lá vối
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài thay đổi nhỏ. Tóm tắt: Chính xác 0,1 ml dịch chiết đã được pha loãng tới nồng độ thích hợp được trộn với 0,9 ml nước cất, sau đó thêm 1 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu’s 1,5 N và cuối cùng thêm 4,5 ml Na2CO3 12,5%.
Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong tối, sau đúng 30 phút, độ hấp thu quang học của hỗn hợp phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sóng 760 nm (Spectrophotometer, Cary 50, Varian, USA). Hàm lượng polyphenol tổng được tính toán từđường chuẩn a xít gallic. Kết quả báo cáo cuối cùng là mg a xít gallic tương đương (GAE)/g dịch chiết.
2.2.2.5. Định lượng flavonoid có trong dịch chiết lá vối
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của Lillian Barros và cộng sự (2007) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cụ thể: Chính xác 0,25 ml dịch chiết đã pha loãng đến nồng độ thích hợp được trộn với nước cất đểđạt thể tích cuối cùng 2,5 ml, sau đó thêm 0,75 ml NaNO2 5%, giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trước khi thêm 0,15 AlCl3 10% và tiếp tục giữ thêm 10 phút ở cùng điền kiện như trên, sau đó thêm 0,5 ml NaOH 1M và cuối cùng thêm 0,275 ml nước cất. Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang học ở bước sóng ở 630 nm (Spectrophotometer, Cary 50, Varian, USA). Hàm lượng flavonoid tổng được tính toán từ đường chuẩn sử dụng Quercetin. Kết quả cuối cùng được báo cáo là mg Quercetin tương đương (QE)/g dịch chiết.
2.2.2.6. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá vối
Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS:Xác định khảnăng khử gốc tự do ABTS theo phương pháp được mô tả bởi Richard và cộng sự (2009) với một vài hiệu chỉnh nhỏ: Tóm tắt:
ABTS (2,2′-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) bị oxi hóa bởi K2S2O8(potassium persufate) để tạo thành gốc tự do ABTS+ (có màu xanh đậm) hấp thụ bước sóng cực đại ở 734 nm. Trong một hỗn hợp phản ứng có mặt chất chống oxi hóa và ABTS+, chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho ABTS+, dẫn đến cường độ màu của hỗn hợp phản ứng giảm. Sự giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng được xác định bằng máy đo quang phổ kế.
Nhiều thể tích mẫu khác nhau trộn với nước cất đểđạt thể tích tổng cộng 5 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch ABTS 12 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ởbước sóng 714 nm (Spectrophotometer, Carry
50, Varian, Australia). Khảnăng khử gốc tựdo ABTS được xác định theo công thức sau: ABTS (%) = 100 × (ACT - ASP)/ACT. Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khửđược 50% gốc tự do ABTS ởđiều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do ABTS càng cao. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Xác định tổng năng lực khử Fe:Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cụ thể: Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate có pH = 6,6 để đạt thể tích cuối cùng 3,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN]6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút, làm nguội bằng vòi nước chảy trong 5 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10% và tiếp đến là 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4 ml AlCl3 0,1% được thêm vào. Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA). Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả được tính toán với giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,5.
2.2.2.7. Xác định hàm lượng a xít béo tự do trong cơ thịt cá nục khô
Cân khoảng 0,3 – 0,5 g dầu được chiết theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) như được trình bày ở Mục 2.2.2.1, được trộn với 5 ml benzene, sau đó thêm 1 ml dung dịch phản ứng Cu-acetate-pyridine, hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trước khi được ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 5 phút. Phần dịch trong ở lớp trên được đem đi xác định độ hấp thụ quang học ởbước sóng 715 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA). Hàm lượng a xít béo tự do được tính toán từ đường chuẩn a xít oleic. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
2.2.2.8. Xác định các chỉ tiêu liên quan đến sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự chuyển dịch của nối đôi liên hợp (CD): Sự chuyển dịch nối đôi liên hợp
được xác định theo phương pháp của Frankel và Huang (1996) với một vài hiệu chỉnh nhỏnhư sau: Khoảng 0,1 – 0,3 g dầu được chiết theo phương pháp của Bligh
và Dyer (1959) được trộn với 5 ml isooctane. Độ hấp thu quang học được đo ởbước sóng 234 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA).
Xác định chỉ số peroxide (PV): Chỉ số peroxide được xác định theo phương pháp của Richard và Hultin (2002) với một vài sự thay đvối nhỏ. Tóm tắt: Cân khoảng 0,1 – 0,3 g dầu, dầu được chiết theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959), sau đó thêm 3,950 ml hỗn hợp chloroform và methanol (3:5, v/v) trước khi thêm 0,025 ml NH4SCN 30%, hỗn hợp được giữ trong 5 phút, rồi thêm 0,025 ml FeCl2, tiếp tục giữ hỗn hợp thêm 10 phút trước khi đo độ hấp thu quang học ởbước sóng 505 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA). Hàm lượng HPO được xác định từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Xác định chỉ số TBARS: Chỉ sốTBARS được xác định theo phương pháp của Lemon (1975) với một vài sựthay đvối nhỏ. Khoảng 5 g thịt cá đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 15 phút, sau đó lọc qua giấy lọc số 1. Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0,02 M theo tỉ lệ thể tích bằng nhau đểđạt thể tích tổng cộng là 6 ml trong một ống nghiệm 10 ml và giữ ở nhiệt độ sôi trong 40 phút. Sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA). Hàm lượng Malonaldehyde (MAD) được tính toán từđường cong chuẩn được xây dựng với nồng độ MAD từ 0,01 đến