1.3.3.1. Phân tích trên thiết bị sắc kí khí ghép nối khối phổ
Phân tích Dioxin trong mẫu sinh phẩm người, trong đó có mẫu sữa mẹ là phép phân tích ở cấp hàm lượng vết/siêu vết (cỡ 10-12 g) nên đòi hỏi phương pháp phân tích sử dụng phải đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu bao gồm độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp, độ chọn lọc và độ chính xác cao để có thể phát hiện và định lượng được từng đồng loại trong mẫu. Vì vậy, thiết bị sắc kí khí ghép nối khối phổ phân giải cao (HRGC/HRMS) đang được sử dụng rộng rãi do ưu điểm nổi trội so với các phương pháp khác về tất cả các yêu cầu trên.[14]
Quá trình phân tích mẫu gồm hai giai đoạn: tách chất trên cột sắc ký và phát hiện và định lượng sử dụng detecto khối phổ.
Hệ sắc kí tách chất sử dụng cột mao quản dựa vào nhiệt độ sôi của từng chất và lực tương tác giữa các chất phân tích với pha tĩnh khi có dòng khí mang đi qua. Nhờ chương trình nhiệt độ của cột, các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ tương tác khác nhau với pha tĩnh và lần lượt đi ra khỏi cột. Tín hiệu được ghi nhận dưới dạng pic với thời gian lưu đặc trưng của từng cấu tử trong hỗn hợp.
Sau khi tách qua cột, các chất lần lượt được đưa vào nguồn ion của hệ khối phổ. Tại đây chúng được phân mảnh thành các mảnh ion có cấu trúc khác nhau nhờ quá trình va chạm electron và được tách nhờ từ trường dựa trên tỉ lệ khối lượng/ điện tích (m/z), sau đó được đi vào bộ nhân quang để chuyển thành tín hiệu điện. Các chất phân tích được định lượng dựa vào tỉ lệ m/z của ion tương ứng.
Trên thế giới, rất nhiều nghiên cứu phân tích Dioxin trong mẫu sinh phẩm người được tiến hành sử dụng thiết bị HRGC/HRMS, một số kết quả nghiên cứu được tóm tắt trong bảng 1.5.
20
Bảng 1.5: Tóm tắt một số kết quả nghiên cứu sử dụng thiết bị HRGC/HRMS
TT Nền mẫu phân tích Kết quả Tài liệu
tham khảo
1 44 mẫu sữa mẹ thu thập tại Pháp
Hàm lượng PCDD/Fs trung bình: 11,4 pg TEQ/g mỡ; Hàm lượng tiêu thụ hàng ngày ở trẻ: 62,3 pg TEQ/kg bw/ngày
[23]
2 8 mẫu sữa thu thập tại Tottori, Nhật Bản
Hàm lượng PCDD/Fs trung bình: 16,7
(Khoảng: 9,6 – 32,7 pg TEQ/g mỡ) [33] 3 Mẫu máu và mẫu sữa
của 125 bà mẹ thu thập tại Hokkaido, Nhật Bản
Hàm lượng trung bình trong máu: 10,5; Khoảng: 0,39 – 30,7 pg TEQ/g mỡ
Hàm lượng trung bình trong sữa: 6,19 (Khoảng: 0,02 – 22,3 pg TEQ/g mỡ)
[27]
4 173 mẫu sữa thu thập tại Australia
Hàm lượng TCDD trumg bình: 0,8 pg/g TEQ k.l mỡ (Khoảng: 0,6 - 1,4 pg/g TEQ mỡ)
[12]
5 10 mẫu máu tổng Hàm lượng PCDD/F trung bình: 0,040
pg/g TEQ (Khoảng: 0,017 – 0,121 ) [28]
1.3.3.2. Phương pháp phân tích CALUX
Hiện nay, CALUX (tên viết tắt của Chemical Activated Luciferase gene
eXpression) là phương pháp phân tích sàng lọc tốt nhất để phân tích Dioxin trong cả nền mẫu môi trường và cả mẫu sinh phẩm người. Phương pháp thể hiện được ưu điểm so với phương pháp phân tích trên thiết bị HRGC/HRMS bao gồm giảm thời gian và giá thành phân tích mà vẫn cho phép phân tích nhanh hàm lượng tổng Dioxin trong mẫu. Tuy nhiên phương pháp này chỉ xác định được hàm lượng tổng các đồng phân chứ không xác định được từng đồng phân riêng rẽ.
Hàm lượng tổng TEQ của mẫu được xác định dựa trên việc đo mật độ ánh sáng huỳnh quang trong phản ứng phát quang của hợp phức AhR-Dioxin trong tế
21
bào ung thư gan chuột khi có mặt cơ chất luciferaza. Cường độ ánh sáng tỉ lệ thuận với lượng cơ chất phản ứng và cũng tỉ lệ thuận với nồng độ TEQ trong mẫu. Cơ chế của phương pháp CALUX được tóm tắt trong hình 1.4, trong đó các hợp chất Dioxin liên kết với phức chất thụ cảm nhân thơm, AhR trong tế bào và di chuyển vào nhân tế bào. Ở đây phức hợp AhR-Dioxin sẽ kết hợp với yếu tố đáp ứng Dioxin trong gen và làm tăng biểu hiện của luciferase. Khi có mặt cơ chất luciferase, ánh sáng huỳnh quang sẽ được phát ra tùy thuộc vào hàm lượng các chất Dioxin có mặt trong mẫu. [20,48]
Hình 1.4: Sơ đồ cơ chế của phương pháp CALUX
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp CALUX để phân tích hàm lượng Dioxin trong mẫu sinh phẩm người cũng như mẫu thực phẩm đã cho thấy hiệu quả tốt khi so sánh với phân tích trên thiết bị HRGC/HRMS, kết quả được tóm tắt trong bảng 1.6.
22
Bảng 1.6: Tóm tắt một số kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp CALUX
TT Đối tượng mẫu
phân tích
Kết qủa phân tích Tài liệu tham
khảo 1 250 mẫu sữa mẹ thu thập tại HongKong Hàm lượng trung bình: 14,5 ± 5,8 pg CALUX-TEQ/g mỡ; Khoảng nồng độ: 3,2 - 33 pg CALUX- TEQ/g mỡ; [10] 2
8 mẫu sữa bò thu thập tại Bỉ
Hàm lượng Dioxin trong khoảng 1- 6 pg TEQ/g mỡ; Hệ số tương quan khi so sánh kết quả với HRGC/HRMS: 0,94
[19]
3
22 mẫu sữa bò thu thập tại Hà Lan
Hàm lượng Dioxin trung bình: 1,6 TEQ/g mỡ (Khoảng nồng độ: 0,2 – 4,6); Hệ số tương quan khi so sánh kết quả với HRGC/HRMS: 0,74
[41]
4
209 mẫu máu thu thập tại Bỉ
Hàm lượng trung bình: 40,5 (Khoảng nồng độ: 5,0- 91,3 pg TEQ/g mỡ); Hệ số tương quan khi so sánh kết quả với HRGC/HRMS: 0,71
[34]
5
341 mẫu huyết tương người thu thập tại Bỉ
Hàm lượng trung bình: 41,8 (Khoảng nồng độ: 5,6- 103,1 pg TEQ/g mỡ); Hệ số tương quan khi so sánh kết quả với HRGC/HRMS: 0,64
23
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Chỉ tiêu phân tích
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành phân tích 17 chỉ tiêu là đồng loại độc của Dioxin bao gồm 7 chỉ tiêu PCDD và 10 chỉ tiêu PCDF. Các chỉ tiêu phân tích được đưa ra trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Mười bảy chỉ tiêu phân tích Dioxin
TT Chỉ tiêu PCDD TT Chỉ tiêu PCDF 1 2,3,7,8-TCDD 1 2,3,7,8-TCDF 2 1,2,3,7,8-PeCDD 2 1,2,3,7,8-PeCDF 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 3 2,3,4,7,8-PeCDF 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 4 1,2,3,4,7,8-HxCDF 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 5 1,2,3,6,7,8-HxCDF 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 6 1,2,3,7,8,9-HxCDF 7 OCDD 7 2,3,4,6,7,8-HxCDF 8 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 9 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 10 OCDF
2.1.2. Đối tượng phân tích
Đối tượng nghiên cứu của luận văn là các mẫu sữa của các bà mẹ sinh con đầu lòng được thu thập tại bốn phường lân cận sân bay Đà Nẵng gồm An Khê, Khuê Trung, Chính Gián và Hòa Thuận Tây. Người cho mẫu phải có thời gian sống tại những khu vực này ít nhất là 5 năm. Vị trí các phường tiến hành lấy mẫu được đánh dấu trong hình 2.1.
24
Hình 2.1: Bản đồ lấy mẫu
Số lượng và kí hiệu mẫu được nêu chi tiết trong bảng 2.2. Bảng 2.2 : Số lượng và kí hiệu mẫu đã thu thập
STT Vị trí lấy mẫu Số lượng mẫu Kí hiệu mẫu
1 An Khê (AK) 6 M1 - M6
2 Khuê Trung (KT) 7 M7 – M13
3 Chính Gián (CG) 7 M14 – M20
4 Hòa Thuận Tây (HTT) 7 M21 – M27
2.2. Nội dung nghiên cứu
Luận văn gồm những nội dung cơ bản như sau:
- Tiến hành thu thập 27 mẫu sữa mẹ tại bốn phường lân cận sân bay Đà Nẵng - Đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích Dioxin trong mẫu sữa thu thập tại Đà Nẵng, thông qua các bước:
25 mẫu trên thiết bị HRGC/HRMS;
+ Kiểm tra độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp phân tích thông qua phân tích mẫu lặp thêm chuẩn trên nền mẫu sữa bột;
- Áp dụng quy trình đã đánh giá vào phân tích mẫu thực tế; đưa ra kết quả hàm lượng Dioxin phân tích được trong mẫu cũng như hàm lượng tiêu thụ hàng ngày trung bình ở trẻ.
- Đánh giá về tình trạng phơi nhiễm Dioxin ở các bà mẹ sinh sống xung quanh sân bay Đà Nẵng và nguy cơ phơi nhiễm ở trẻ em qua con đường bú sữa.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Phương pháp lấy mẫu
Trước khi tiến hành lấy mẫu, chúng tôi tiến hành thu thập thông tin của người tình nguyện cho mẫu bao gồm tuổi, thời gian cư trú, thời gian cho trẻ bú sữa, từng sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ sân bay Đà Nẵng (thực phẩm được đánh bắt hoặc nuôi trồng trực tiếp trong sân bay hoặc thực phẩm mua tại các chợ gần sân bay)… và từ đó chọn ra đối tượng phù hợp. Mẫu sữa được thu thập vào tháng 12/2011 với các thông tin cơ bản được tóm tắt trong bảng 2.3.
Bảng 2.3: Tóm tắt thông tin mẫu sữa mẹ tại Đà Nẵng
Phường Tuổi Thời gian cư trú (năm) Thời gian cho
bú (tháng)
Tiêu thụ thực phẩm
(%)
TB Khoảng TB Khoảng TB Khoảng
KT (n=6) 30 19-29 22 10-30 5 2-9 11
AK (n=7) 29 25-33 16 16-29 3,5 1-7,5 50
HTT(n=7) 29 23-28 22 5-28 3,5 1-8 -
CG(n=7) 29 22-40 23 13-29 4 1,5-8 22
Phần trăm tiêu thụ thực phẩm của từng phường được tính bằng cách lấy phần trăm số bà mẹ đã từng tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ sân bay Đà Nẵng trên tổng số bà mẹ đã phỏng vấn. Trong bốn phường đã lấy mẫu, phường Hòa Thuận
26
Tây không có thông tin về phần trăm tiêu thụ thực phẩm.
Mẫu được thu thập với thể tích ít nhất 50 mL vào lọ thủy tinh có nắp vặn lót Teflon và được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -40C. Sau đó mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm và được bảo quản ở tủ âm sâu -200C cho đến khi tiến hành phân tích.
2.3.2. Phương pháp phân tích mẫu
Chuẩn bị mẫu:
Trước khi tiến hành phân tích, mẫu được tiến hành đông khô để chuyển từ dạng dung dịch sữa về dạng mẫu bột, dễ dàng cho quá trình tách chiết. Mẫu được tiến hành đông khô bằng máy đông khô, Unicryo MC6L trong thời gian 24h.
Chuẩn bị mẫu giả:
Trong luận văn này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát dung môi chiết và phân tích mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu là sữa bột Similac Gain IQ, Abbot, Hoa Kì với hàm lượng mỡ ghi trên bao bì là 23,8%.
Khảo sát hệ dung môi chiết mẫu
Mẫu được chiết sử dụng hỗn hợp dung môi gồm Hexan, Diclometan và một dung môi phân cực. Yếu tố khảo sát là loại dung môi phân cực Metanol hoặc Etanol và tỉ lệ dung môi thích hợp. Loại dung môi và tỉ lệ được lựa chọn để tiến hành chiết mẫu phải đảm bảo được hiệu quả chiết mỡ tốt (đánh giá thông qua độ thu hồi mỡ trong mẫu giả).
Chiết mẫu
Dung dịch nội chuẩn được thêm vào hỗn hợp mẫu đã trộn đều với muối Na2SO4 khan. Sau đó hỗn hợp ở trên được tiến hành chiết trên PLE bằng dung môi thích hợp với chương trình chiết đã được cài đặt trước. Hiệu suất của toàn bộ quá trình phân tích được đánh giá thông qua độ thu hồi của chất nội chuẩn.
27
Dung dịch chuẩn làm sạch, 37Cl-2,3,7,8-TCDD được thêm vào dịch chiết mẫu trước khi tiến hành làm sạch trên hệ làm sạch bán tư động, hãng Supelco. Sau đó hỗn hợp dịch chiết mẫu và chuẩn được làm sạch trên hệ gồm hai cột Silica đa lớp và cột Cacbon hai lớp. Hiệu suất của quá trình làm sạch được đánh giá dựa trên độ thu hồi của chất chuẩn làm sạch.
Phát hiện và Định lượng trên thiết bị HRGC/HRMS
Phương pháp định lượng các chất Dioxin trên hệ thống HRGC/HRMS được tham khảo từ phương pháp tiêu chuẩn USEPA 1613 với một số thay đổi phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Các thí nghiệm trên hệ thống phân tích bao gồm: xác định các chất Dioxin dựa vào thời gian lưu và mảnh phổ của ion đặc trưng của từng đồng loại, dựng đường chuẩn gồm 5 điểm chuẩn của 17 chất đồng loại Dioxin (với nồng độ của từng đồng loại trong bảng 2.4), xác định các giá trị giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp và định lượng chất phân tích sử dụng đường chuẩn theo phương pháp pha loãng đồng vị và nội chuẩn.
Đánh giá độ đúng và độ chụm của phương pháp
Với hệ dung môi đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu sữa bột và tiến hành phân tích 06 mẫu lặp, hàm lượng của các chất trong dung dịch thêm chuẩn trong phụ lục 2. Độ đúng và độ chụm của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi chất chuẩn và độ lặp lại của phương pháp phân tích.
Phân tích mẫu thực tế
Sau khi đánh giá phương pháp phân tích đảm bảo yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại cho phương pháp phân tích Dioxin theo phương pháp tiêu chuẩn USEPA 1613, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thực tế.
2.4. Hóa chất, chất chuẩn, dụng cụ, thiết bị
2.4.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng phải có độ tinh khiết sử dụng cho phân tích, sắc kí khí và sắc kí lỏng do các công ty Merck, Aldrich Sigma, Supelco, Fluka…sản xuất, bao gồm:
28 - n-Hexan (C6H14) - Toluen (C6H5CH3) - Diclometan (CH2Cl2) - Axeton (CH3COCH3) - Metanol (CH3OH) - Etanol (C2H5OH)
- Muối natri sunfat khan (Na2SO4)
2.4.2. Chất chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc sử dụng theo phương pháp tiêu chuẩn EPA - 1613 do công ty Radian Corporation, Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Mỹ) sản xuất gồm có:
- Dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn: C1–C5; 0,5 – 2000 pg/L
- Dung dịch thêm chuẩn: 400 - 4000 pg/L, được sử dụng khi tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn
- Dung dịch chất chuẩn đánh dấu hay dung dịch nội chuẩn: 100 – 200 pg/L, được sử dụng để xác định hiệu suất của toàn bộ quá trình phân tích
- Dung dịch chất chuẩn làm sạch: 8,0 pg/L, được sử dụng để xác định hiệu suất của quá trình làm sạch dịch chiết mẫu qua hệ cột làm sạch
- Dung dịch chất chuẩn thu hồi: 200 pg/L, được sử dụng để tính toán hiệu suất thu hồi của chất chuẩn đánh dấu.
Nồng độ của từng chất chuẩn được biểu diễn trong phụ lục.
Khi dựng đường chuẩn của 17 đồng loại độc của Dioxin, dung dịch chuẩn gốc C1 - C5 được pha loãng, nồng độ dung dịch dựng đường chuẩn (MC1-MC5) trong bảng 2.4.
Bảng 2.4: Nồng độ dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn
TT Tên chất Nồng độ dung dịch (pg/μL)
MC1 MC2 MC3 MC4 MC5
1 2,3,7,8-TCDD 0,05 0,2 1 4 20
29 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,25 1 5 20 100 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,25 1 5 20 100 5 1,2,3,7,89-HxCDD 0,25 1 5 20 100 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,25 1 5 20 100 7 OCDD 0,5 2 10 40 200 8 2,3,7,8-TCDF 0,05 0,2 1 4 20 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,25 1 5 20 100 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,25 1 5 20 100 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,25 1 5 20 100 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,25 1 5 20 100 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,25 1 5 20 100 17 OCDF 0,5 2 10 40 200 Chất chuẩn đánh dấu 1 13C12-2,3,7,8-TCDD 10 10 10 10 10 2 13C12-1,2,3,7,8-PeCDD 10 10 10 10 10 3 13C12-1,2,3,4,7,8-HxCDD 10 10 10 10 10 4 13C12-1,2,3,6,7,8-HxCDD 10 10 10 10 10 5 13C12-1,2,3,7,89-HxCDD 10 10 10 10 10 6 13C12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 10 10 10 10 10 7 13C12-OCDD 20 20 20 20 20 8 13C12-2,3,7,8-TCDF 10 10 10 10 10 9 13C12-1,2,3,7,8-PeCDF 10 10 10 10 10 10 13C12-2,3,4,7,8-PeCDF 10 10 10 10 10 11 13C12-1,2,3,4,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 12 13C12-1,2,3,6,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 13 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDF 10 10 10 10 10 14 13C12-2,3,4,6,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 15 13C12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 10 10 10 10 10 16 13C12-1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 10 10 10 10 10 Chất chuẩn làm sạch 23 37Cl4-2,3,7,8-TCDD 0,05 0,2 1 4 20
Chất chuẩn thu hồi