2.3.2.1. Phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin:
Mẫu lạc nhân và lạc củ được xác định hàm lượng AF (B1, B2, G1, G2) bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS theo [6, 7].
Nguyên lý: Mẫu được chiết bằng cloroform và làm sạch trên cột chiết pha rắn Si.
Aflatoxins được tách và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ sử dụng cột pha đảo C18.
Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu rắn được xay nhỏ, trộn đều: Cân chính xác
khoảng 10-20 g trên cân phân tích vào bình nón 250 ml. Mẫu nước và mẫu lỏng: Cân khối lượng hoặc hút thể tích trực tiếp tương đương khoảng 10 - 20 g vào bình nón 250 ml
Chiết aflatoxin trong các sản phẩm chứa ít chất béo: Thêm 100 ml cloroform vào mẫu đã chuẩn bị ở trên. Lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang. Sau đó được lọc qua giấy lọc vào bình cô quay 250 ml. Dịch chiết được cô quay bằng máy cô quay chân không ở 40C đến cạn. Sau đó được hòa cặn bằng 10 ml diclomethan
Chiết Aflatoxin trong các sản phẩm nhiều chất béo: Thêm 100 ml hỗn hợp methanol: nước (85:15, ….) vào mẫu đã được chuẩn bị ở trên, lắc đều. Hỗn hợp được lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang . Sau đó được lọc qua giấy lọc. Lấy 40 ml dịch lọc ở trên cho vào phễu chiết 500 ml, thêm 40 ml dung dịch NaCl 1%, sau đó thêm 25 ml n-hexan vào và lắc đều để chiết loại chất béo. Để yên đến khi phân lớp rồi lấy lớp dưới vào phễu chiết khác, lớp phía trên loại bỏ. Lớp dưới được thêm 25 ml cloroform vào và lắc đều để chiết aflatoxin, để lắng đến khi phân lớp. Lấy lớp dưới, lớp trên được chiết lặp lại lần 2 với 25 ml cloroform. Dịch của hai lần chiết được gộp vào bình cất quay 100 ml. Sau đó được cô quay bằng máy cô quay chân không ở 40C đến cạn. Sau đó được hòa cặn bằng khoảng 10 ml diclomethan và làm sạch trên cột SPE-Si. Cột được hoạt hóa bằng 3ml n-hexan, 3ml diclomethan. Mẫu được nạp qua cột với tốc độ 1 - 2 ml/phút. Sau đó được rửa tạp với 3 ml n-hexan, 3 ml diclomethan. Chất phân tích được rửa giải ra bằng 10 ml hỗn hợp cloroform- acetone (90 : 10) vào bình cô quay 100 ml.
Dịch rửa giải được cô quay đến cạn và hòa cặn bằng 1 ml methanol và được bơm vào hệ thống LC-MS/MS.
* Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC): Lặp tương tự các bước như trên nhưng có
thêm chuẩn aflatoxins vào mẫu trắng trước khi chiết mẫu để xác định độ thu hồi và loại bỏ sai số trong quá trình thực hiện thao tác. Mẫu spike: thêm chính xác 100µl dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu trắng rồi tiến hành phân tích giống mẫu thử.
* Mẫu trắng: Mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử trên mẫu đã xác định
là không có các aflatoxins nói trên.
Điều kiện chạy máy
- Cột sắc ký pha đảo C18 Waters hoặc tương đương: 250 mm, 4,6 mm, 4,5µm - Pha động: chạy theo chương trình gradient như sau:
Thời gian (phút) Tỷ lệ % MeOH Tỷlệ % Amoniacetat 10 mM
0,01 5 95
4 100 0
5,01 5 95
10 5 95
- Thể tích bơm mẫu: 10 µl.
- Tốc độ dòng pha động:1,0 ml/phút
- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI 5500 QQQ. Các điều kiện khối phổ có thể khác nhau đối với các thiết bị khối phổ khác nhau, cần thực hiện tối ưu điều kiện bằng chất chuẩn aflatoxins.
Nguồn ion hóa Electrospray (ESI)
Thế ion hóa 4000 KV
Chế độ Ion dương
Nhiệt độ nguồn 300 0C
Khí Curtain gas: 25 psi
Ion source gas 1 : 30 psi Ion source gas 2 : 10 psi
Năng lượng bắn phá CE = 30 eV
Định tính: Để xác nhận sự có mặt của chất phân tích trên LC-MS/MS, ngoài sự
trùng lặp về thời gian lưu tương ứng của mỗi chất còn căn cứ vào tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion định lượng và ion định tính. Tỷ lệ này của aflatoxin G2, G1, B2, B1 lần lượt là: 1,1-1,4; 4,3-4,6; 1,2-1,3; 0,6-0,7. Tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào độ nhạy của thiết bị.
Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau.
X = V x K x Cm/m
Trong đó : V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy (ml)
Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/ml) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)
X: hàm lượng aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g) K: Hệ số pha loãng
Mỗi mẫu làm một lần. Thực hiện bơm mẫu theo đúng quy trình chạy máy. Mỗi lô làm ít nhất 1 mẫu thu hồi, một mẫu trắng:
Mẫu trắng phải không có tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích.
2.3.2.2. Phương pháp kiểm nghiệm fumonisin B1:
Nguyên lý: Hàm lượng fumonisin B1 trong ngũ cốc được chiết lỏng lỏng với
dung môi acetonitril (ACN), methnol (MeOH), nước (25/25/50) có bổ sung muối MgSO4 và NaCl giúp cho quá trình tách lớp hiệu quả. Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,2 µm. Dịch chiết cuối cùng được phân tích bằng LC-MS/MS.
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Mẫu ngũ cốc dạng hạt được nghiền bằng máy đồng nhất
mẫu. Mẫu đã ở dạng bột không cần nghiền nhưng phải trộn đều trước khi phân tích.
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g mẫu trên cân phân tích (2.2.1.3) vào ống ly tâm 15ml.
- Thêm 5 ml dung dịch chiết ACN : MeOH : H2O (25/25/50,v/v/v) (6.1.8) vào ống ly tâm, đậy nắp kín, lắc trộn đều bằng tay vài lần.
- Thêm từ từ hỗn hợp muối chiết đã được chuẩn bị sẵn (2.2.2.13), đậy nắp kín, lắc trộn đều bằng máy lắc trong 1 phút.
- Ly tâm ở tốc độ 6000 rpm trong 5 phút.
- Hút lớp trên, thêm tiếp 5 ml dung dịch chiết ACN : MeOH : H2O (25/25/50,v/v/v) và lặp lại bước trên.
- Gộp dịch chiết hai lần lọc qua màng lọc 0,2 µm, thêm 0,75 ml nước vào 0,5 ml dịch đã lọc và đem phân tích bằng LC-MS/MS.
Ghi chú: Mẫu sau khi chiết nên được phân tích ngay, nếu không thể phân tích
ngay thì có thể bảo quản ở 2-8 0C nhưng không quá 2 ngày.
Mẫu trắng: mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử trên mẫu rau quả đã xác
định là không có fumonisin B1.
Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC):Tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng có cho
thêm một lượng chuẩn chính xác đã biết nồng độ. Có thể lựa chọn các cách thêm sau đây nhưng tối thiểu một lô mẫu phân tích cần có một mẫu QC.
Điều kiện chạy máy: - Điều kiện LC: + Cột sắc ký Xbridge C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm)và tiền cột + Tốc độ dòng 0,6 ml/min + Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng + Thể tích tiêm mẫu 10µl
+ Pha động: theo chế độ gradient như bảng dưới
Thời gian (min) Acid acetic 0,1 % trong nước Acetonitrile (%)
0,01 90 10
3,00 0 100
8,00 0 100
8,01 90 10
12,00 90 10
- Điều kiện khối phổ:
Nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương (+), thế phun 4500 kV Nhiệt độ đầu phun (IS) 450 0C
Curtain Gas (CUR) 20 Collision gas (CAD) 7 Ion source gas 1 (GS1) 20 Ion source gas 2 (GS1) 15
Tính toán kết quả
Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa diện tích và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu ta tính được hàm lượng fumonisin B1 trong dung dịch chạy máy.
Hàm lượng fumonisin B1 trong mẫu được tính theo công thức sau:
= × ×
Trong đó:
Xi: Hàm lượng fumonisin B trong mẫu (ng/g)
Ci: Hàm lượng fumonisin B1 trong dịch cuối (ng/ml) V: Thể tích dịch chiết (ml)
k: Hệ số pha loãng (nếu có) m: Khối lượng mẫu phân tích (g)
Tính độ thu hồi của mẫu QC theo công thức:
% = × 100
Trong đó: R%: Độ thu hồi (%)
Xt: Hàm lượng fumonisin B1 tính được trong mẫu (ng/g) Cc: Hàm lượng fumonisin B1 thêm vào ban đầu (ng/g)
2.3.2.3. Thẩm định phương pháp:
2.3.2.3.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các tạp chất hoặc các chất khác tiến hành như sau.
Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký lỏng khối phổ chúng tôi sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method). Theo Hội đồng Châu Âu điểm IP (điểm nhận dạng- identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con[14].
Hơn nữa để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/chọn lọc cao, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng không cho tín hiệu phân tích, mẫu trắng có thêm chất chuẩn.
2.3.2.3.2. Khoảng tuyến tính
Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng độ của chất đó.
Phương trình hồi quy tuyến tính yaxb
Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích chất chuẩn x là nồng độ chất khảo sát
2.3.2.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)[10].
Hoặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:
Tính giá trị nồng độ trung bình xtb, độ lệch chuẩn SD (S) LOD = 3.S
Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị R = LODxtb
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch đem thử là phù hợp và giá trị LOD tính được là đáng tin cậy.
Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được. Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD. [10].
2.3.2.3.4. Độ lặp lại
Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu. Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích. Các công thức tính toán như sau [10]:
Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại. + Giá trị trung bình : n 1 i i x n 1 x
Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn : 1 n ) x x ( SD 2 n 1 i i
+ Độ lệch chuẩn tương đối:
1 1 2 N x x S N i i
100 X SD
RSD
2.3.2.3.5. Độ đúng
Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value) [10].
- Phân tích mẫu chuẩn (vật liệu chuẩn): Mẫu đã biết trước nồng độ của chất phân
tích. Kết quả tính ra độ chệch: Độ chệch = x x 100 x : kết quả phân tích được
: giá trị đúng của chất phân tích
Trong trường hợp tham gia phân tích các mẫu thử nghiệm liên phòng thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giá trị Zscore. Zscore được tính như sau:
Zscore =
x
Trong đó: là độ lệch chuẩn tham chiếu Nếu |Zscore| ≤ 2: Kết quả được chấp nhận
2 < |Zscore| ≤ 3: Kết quả có nghi ngờ
|Zscore| > 3: Kết quả có sai lệch.
- Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn.
Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%) được tính như sau: 100 C C C % R c m c m
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm 2.3.2.4. Phương pháp xử lý số liệu :
- Tính toán kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel
- Tính toán thời gian lưu, diện tích pic, chiều cao pic và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng phần mềm của thiết bị.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin