1.2.2.1. Một số nghiên cứu của enzyme cellulase
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase và β-glucosidase có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp trong công nghiệp lên men. Cellulase hoạt động tốt ở pH = 3.8 ÷ 5.0 và nhiệt độ dưới 500C.
Hình 1.5: Cấu tạo và cơ chế tác dụng của enzyme cellulase lên cellulose
-Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4-glucoside trong cellulose, lignin và α-D-glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
-Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetro.
-Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetro thành glucose.
1.2.2.2. Một số ứng dụng của enzyme cellulase
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em.
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hoại tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa.
Trong sản xuất agar – agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar –agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của
cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt, tuy vậy, hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm cellulase có hoạt độ cao.
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy: giúp làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, người ta cũng sử dụng cellulase để tẩy mực in các loại giấy thải trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết.
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, phức hệ enzyme cellulase và pectinase được sử dụng để xử lý bóc vỏ và tăng khả năng trích ly dịch quả.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phê thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi.
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase có vai trò quan trọng giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1.5%.
1.2.3. Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme hemicellulase 1.2.3.1. Một số nghiên cứu của enzyme hemicellulase 1.2.3.1. Một số nghiên cứu của enzyme hemicellulase
Hemicellulase là một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm: Xylan endo- 1,3-β-xylosidase, EC 3.2.1.55; hemicellulase hoạt động tốt ở pH = 4.5 ÷ 5.5 và nhiệt độ dưới 500C.
Hemicellulase là một enzyme thủy phân hemicellulose. Hemicellulose là một dạng của polysaccharide có mặt ở thành tế bào, kém bền, có thể bị thủy phân bởi dung dịch acid yếu và kiềm.
Hình 1.6: Cấu tạo của enzyme hemicellulase
Hemicellulase là một hỗn hợp enzyme có thể thủy phân những thành phần khó tiêu hóa của mô thực vật. Nó sẽ tấn công vào hemicellulose và giải phóng ra những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
1.2.3.2. Một số ứng dụng của enzyme hemicellulase
Hemicellulase có khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl trên 22% trong điều kiện pH = 4.5, nhiệt độ 370C và sản phẩm thu được là (C6H11O4N)n với n = 1 ÷ 7. Sản phẩm có khả năng hòa tan tốt trong nước và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghệ thực phẩm, trong y học và trong nông nghiệp.
Ngoài ra, hemicellulase được ứng dụng nhiều trong xử lý phế liệu rau quả (núm quả, lõi quả, rau…) vì hemicellulose trong rau quả chủ yếu là pentose, hemicellulase sẽ thủy phân pentose tạo thành những phân tử đường có khối lượng thấp hơn, giúp cơ thể sinh vật hấp thu tốt hơn.
Hiện nay, hemicellulase còn được ứng dụng trong sản xuất dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH = 7, nhiệt độ 500C, thời gian 6 ngày với cơ chất là cơm dừa và phôi dừa.
Trong công nghệ sản xuất bia, nếu dùng nguồn nguyên liệu tinh bột khác thay thế malt với tỷ lệ cao sẽ bổ sung thêm enzyme hemicellulase nhằm đường hóa các tinh bột.
Hemicellulase được ứng dụng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp thành các hợp chất đợn giản, dễ tiêu hóa.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu để sản xuất COS là chitosan được sản xuất từ vỏ tôm sú theo quy trình của Trần Thị Luyến, với các chỉ tiêu chất lượng như sau:
-Màu sắc: trắng ngà -Trạng thái: mềm mại
-Hàm lượng chất không tan: 1.6% -Độ nhớt: 66.7cp -Độ ẩm: 9.5% -Nitơ tổng quát: 4.05% -Độ deacetyl hóa: 76.25% -Hàm lượng tro: 0.4% Hình 2.1: Vật liệu chitosan dạng bột
Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của Sigma – Mỹ do thầy Tiến sĩ Vũ Ngọc Bội cung cấp.
Enzyme có các đặc điểm sau: -Dạng bột
-Tan trong nước
-Hoạt tính: 1.5 đơn vị hoạt tính/mg
Hình 2.2: Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger
Enzyme Cellulase, sản phẩm của Novozymes, do thầy Tiến sĩ Vũ Ngọc Bội cung cấp.
Enzyme có các đặc điểm sau: -Dạng dung dịch
-Màu nâu đen
-Hoạt tính: 0.7 đơn vị hoạt tính/ml
Hình 2.3: Enzyme cellulase 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân tích
Nguyên tắc: hoạt tính của enzyme cellulase và hemicellulase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm D-glucosamine của quá trình phân giải chitosan.
- Xác định hàm lượng chất không tan
Nguyên lý: hòa tan COS vào trong nước, sau một thời gian nhất định tiến hành lọc dung dịch, sau đó cân giấy lọc và bã không tan còn lại.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm2.2.2.1. Quy trình dự kiến 2.2.2.1. Quy trình dự kiến
Quy trình dự kiến thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase và hemicellulase như sau:
Hòa tan chitosan bằng acid acetic loãng 2%, sau đó đưa chitosan đi thủy phân bằng hai loại enzyme khác nhau là cellulase và hemicellulase. Trong công đoạn thủy phân cần kiểm soát chặt chẽ các thông số: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân. Sản phẩm thủy phân thu được ở dạng lỏng nên tiến hành kết tủa chúng rồi sấy lạnh, thu được COS dạng rắn.
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình dự kiến thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase và hemicellulase
Từ quy trình hình 2.4 tiến hành nghiên cứu các thông số cần thiết cho quy trình.
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số của quy trình
* Xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân Chitosan bột Hòa tan Thủy phân Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS -Nồng độ enzyme -Nhiệt độ -pH -Thời gian Đun cách thủy
Chitosan bột Hòa tan Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS Thủy phân
[En.] = 1% [En.] = 2% [En.] = 3% [En.] = 4%
Sản phẩm thủy phân
Đánh giá hiệu suất
Xác định nồng độ enzyme thủy phân thích hợp Đun cách thủy
- Nhiệt độ: 370C -Thời gian: 5 ngày -pH = 3.8 (cellulase) và
pH = 4.5 (hemicellulase)
Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
Căn cứ vào công trình nghiên cứu của Aiba và Muraki (1996) và phương pháp thăm dò cổ điển về hai loại enzyme cellulase và hemicellulase, trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân, tôi tiến hành khảo sát nồng độ enzyme từ 1 ÷ 4% so với cơ chất, tại pH 3.8 (đối với enzyme cellulase) và pH 4.5 (đối với enzyme hemicellulase), thời gian là 5 ngày, nhiệt độ thủy phân là 370C. Căn cứ vào hiệu suất của quy trình để chọn ra thông số thủy phân thích hợp.
Chitosan bột Hòa tan Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS - [En.] thích hợp -Thời gian: 4 ngày -pH = 3.8 đối với
cellulase và pH = 4.5 đối với hemicellulase Thủy phân
t0=32±0.50C
Sản phẩm thủy phân
Đánh giá hiệu suất
Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp Đun cách thủy
t0=37±0.50C t0=42±0.50C t0=47±0.50C t0=52±0.50C
Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Căn cứ vào công trình nghiên cứu của Aiba và Muraki (1996) và phương pháp thăm dò cổ điển về hemicellulase và cellulase, trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân, tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ từ 32 ÷ 520C (320C, 370C, 420C, 470C, 520C), tại pH 3.8 (đối với enzyme cellulase) và pH 4.5 (đối với enzyme hemicellulase), thời gian 4 ngày (100 giờ) và nồng độ enzyme thủy phân thích hợp xác định theo quy trình hình 2.5. Căn cứ vào hiệu suất của quy trình để chọn ra thông số thủy phân thích hợp.
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
* Hóa chất:
Các loại hóa chất được phép sử dụng trong phòng thí nghiệm. * Dụng cụ:
-Pipet, micropipet -Ống đong
-Bình tam giác, phễu lọc -Cốc thủy tinh, bình định mức -Hũ nhựa các loại 100 ml và 250 ml * Thiết bị: -Bể ổn nhiệt -Nhiệt kế -Máy đo pH
-Cân điện tử, tủ lạnh, tủ đông -Máy đo độ nhớt
-Máy đo OD -Máy ly tâm
-Tủ sấy, tủ sấy chân không -Tủ nung
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp cổ điển, sử dụng phần mềm Excel.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME CELLULASE VÀ HEMICELLULASE TRONG THỦY PHÂN CHITOSAN
3.1.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan chitosan
Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 4 mẫu thí nghiệm thủy phân chitosan bằng hai loại enzyme cellulase và hemicellulase ở cùng điều kiện nhiệt độ 370C, thời gian 5 ngày, pH 3.8 đối với enzyme cellulase và pH 4.5 đối với enzyme hemicellulase, tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: 1%, 2%, 3% và 4%. Trong quá trình thủy phân thường xuyên khuấy đảo và đo độ nhớt. Sau khi thủy phân, đem đun sôi dung dịch để vô hoạt enzyme, lọc và điều chỉnh pH về 7 bằng dung dịch kiềm, sử dụng cồn 99.50 để kết tủa oligochitosan. Ly tâm thu kết tủa rồi sấy lạnh ở 300C ta thu được COS dạng vảy. Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 15 18 21 22 43 60 65 132
Thời gian thủy phân (giờ)
Đ ộ n h ớ t (c p ) [Cellulase] 1% [Cellulase] 2% [Cellulase] 3% [Cellulase] 4% [Hemicellulase] 1% [Hemicellulase] 2% [Hemicellulase] 3% [Hemicellulase] 4%
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thay đổi độ nhớt dung dịch thủy phân
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 1% 2% 3% 4% Nồng độ enzyme (%) H iệ u s u ấ t th u C OS ( % ) Cellulase Hemicellulase
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thu COS Nhận xét
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy:
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme cellulase:
Từ các kết quả phân tích ở hình 3.1 cho thấy theo thời gian thủy phân, các mẫu thí nghiệm đều có hiện tượng giảm độ nhớt, mẫu bổ sung tỷ lệ enzyme lớn hơn có mức độ giảm độ nhớt nhanh hơn. Như vậy chứng tỏ enzyme cellulase có khả năng thủy phân chitosan.
Đối với mẫu thủy phân chitosan sử dụng enzyme cellulase ở nồng độ 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian thủy phân nhưng mức độ giảm độ nhớt chậm hơn các mẫu sử dụng 2% và 3% enzyme. Vào thời điểm sau 132h thủy phân dịch cơ chất chỉ còn độ nhớt là 9.60cp, giảm 85.61% so với ban đầu và hiệu suất thu oligochitosan (COS) đạt 60.18%. Ở nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian và tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch chitosan chỉ còn 8.88cp, giảm 86.69% so với ban đầu và thấp hơn một chút so với dung dịch thủy phân chitosan dùng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung là 1%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 63.53%. Cũng tương tự như vậy, khi sử dụng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung 3%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm nhanh hơn khi sử dụng tỷ lệ enzyme là 1% và 2%; tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch
chitosan còn là 8.64cp giảm 87.05% so với ban đầu, thấp hơn so với độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan sử dụng tỷ lệ enzyme bổ sung 1% và 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.16%. Tuy vậy, khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung lên 4%, độ nhớt dung dịch cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm chỉ chênh lệch so với khi dùng tỷ lệ enzyme 1% và 2%, so với mẫu sử dụng tỷ lệ enzyme 3% thì mức độ chênh lệch không đáng kể, tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan là 8.52cp thấp hơn không đáng kể so với độ nhớt của mẫu thủy phân dùng 3% enzyme và hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.28%.
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme hemicellulase:
Tương tự như việc sử dụng enzyme cellulase thủy phân chitosan, enzyme hemicellulase cũng có khả năng thủy phân chitosan nhưng mức độ thủy phân chậm hơn thể hiện qua việc theo thời gian độ nhớt của dung dịch thủy phân giảm chậm hơn so với mức độ giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân khi sử dụng enzyme cellulase. Cụ thể với nồng độ enzyme 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân sau 132h thủy phân là 35.90cp – cao hơn rất nhiều so với độ nhớt của mẫu thủy phân bằng cellulase 1%, hiệu suất thu COS tương ứng chỉ đạt 39.94% đương nhiên cũng thấp hơn mẫu thủy phân bằng cellulase 1%. Tương tự như vậy, với nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân chỉ là 34.40cp – cũng cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 42.31%, tất nhiên cũng thấp hơn so với mẫu cellulase 2%. Tại nồng độ enzyme 3%, độ nhớt dung dịch ở thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch là 31.80cp – cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 3%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 53.54%, thấp hơn mẫu cellulase 3%. Tại nồng độ enzyme 4%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân là 31.30cp – cao hơn nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 4%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 54.10%, thấp hơn mẫu cellulase 4%.
Kết quả cho thấy, đối với cả hai loại enzyme thủy phân đã sử dụng, ở nồng độ enzyme sử dụng là 3% và 4% thì hiệu suất thu COS và giá trị độ nhớt của dịch