1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme
Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống đều do enzyme xúc tác. Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc biệt cho các phản ứng hóa học, chúng không những có khả năng xúc tác cho những phản ứng xảy ra trong tế bào sống mà sau khi tách ra khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học. Mặt khác, enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm nghìn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường.
Ví dụ: trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2x1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác.
Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi không phân cực. Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử
lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat. Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng là làm môi trường cho các phản ứng sinh hóa.
Enzyme cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein. Các tác nhân vật lý và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme vì vậy enzyme cũng bị mất hoạt tính khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng.
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau:
ES + S ES P + E Trong đó:
E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme – cơ chất; P: sản phẩm Enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn I: enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra và đòi hỏi năng lượng thấp.
Giai đoạn II: là giai đoạn tạo ra phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn III: là giai đoạn tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu.
Enzyme có trong mọi tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật. Do vậy người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn này để sử dụng trong công nghiệp. Một số nguyên liệu dùng để tách chiết enzyme là:
Từ thực vật: nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và quả dứa tách bromelain, …
Từ động vật: từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận nhiều enzyme khác nhau như từ dạ dày có thể thu được pepsin, từ tụy tạng thu được trypsin, …
Từ vi sinh vật: vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loại: Aspergillus, Baccillus, Pencillium, Clostridium, Streptomyces và các loại nấm men. Vi sinh vật là đối tượng thích hợp nhất để sản xuất enzyme bởi chúng có các ưu điểm sau:
- Có thể chủ động quá trình sản xuất
- Chu kỳ sinh trưởng phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong một thời gian ngắn (36 – 60 giờ)
- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn
- Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các chế phẩm enzyme từ các nguồn khác vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền.
1.2.2. Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme cellulase1.2.2.1. Một số nghiên cứu của enzyme cellulase 1.2.2.1. Một số nghiên cứu của enzyme cellulase
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase và β-glucosidase có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp trong công nghiệp lên men. Cellulase hoạt động tốt ở pH = 3.8 ÷ 5.0 và nhiệt độ dưới 500C.
Hình 1.5: Cấu tạo và cơ chế tác dụng của enzyme cellulase lên cellulose
-Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4-glucoside trong cellulose, lignin và α-D-glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
-Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetro.
-Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetro thành glucose.
1.2.2.2. Một số ứng dụng của enzyme cellulase
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em.
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hoại tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa.
Trong sản xuất agar – agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar –agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của
cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt, tuy vậy, hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm cellulase có hoạt độ cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy: giúp làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, người ta cũng sử dụng cellulase để tẩy mực in các loại giấy thải trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết.
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, phức hệ enzyme cellulase và pectinase được sử dụng để xử lý bóc vỏ và tăng khả năng trích ly dịch quả.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phê thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi.
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase có vai trò quan trọng giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1.5%.
1.2.3. Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme hemicellulase 1.2.3.1. Một số nghiên cứu của enzyme hemicellulase 1.2.3.1. Một số nghiên cứu của enzyme hemicellulase
Hemicellulase là một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm: Xylan endo- 1,3-β-xylosidase, EC 3.2.1.55; hemicellulase hoạt động tốt ở pH = 4.5 ÷ 5.5 và nhiệt độ dưới 500C.
Hemicellulase là một enzyme thủy phân hemicellulose. Hemicellulose là một dạng của polysaccharide có mặt ở thành tế bào, kém bền, có thể bị thủy phân bởi dung dịch acid yếu và kiềm.
Hình 1.6: Cấu tạo của enzyme hemicellulase
Hemicellulase là một hỗn hợp enzyme có thể thủy phân những thành phần khó tiêu hóa của mô thực vật. Nó sẽ tấn công vào hemicellulose và giải phóng ra những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
1.2.3.2. Một số ứng dụng của enzyme hemicellulase
Hemicellulase có khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl trên 22% trong điều kiện pH = 4.5, nhiệt độ 370C và sản phẩm thu được là (C6H11O4N)n với n = 1 ÷ 7. Sản phẩm có khả năng hòa tan tốt trong nước và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghệ thực phẩm, trong y học và trong nông nghiệp.
Ngoài ra, hemicellulase được ứng dụng nhiều trong xử lý phế liệu rau quả (núm quả, lõi quả, rau…) vì hemicellulose trong rau quả chủ yếu là pentose, hemicellulase sẽ thủy phân pentose tạo thành những phân tử đường có khối lượng thấp hơn, giúp cơ thể sinh vật hấp thu tốt hơn.
Hiện nay, hemicellulase còn được ứng dụng trong sản xuất dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH = 7, nhiệt độ 500C, thời gian 6 ngày với cơ chất là cơm dừa và phôi dừa.
Trong công nghệ sản xuất bia, nếu dùng nguồn nguyên liệu tinh bột khác thay thế malt với tỷ lệ cao sẽ bổ sung thêm enzyme hemicellulase nhằm đường hóa các tinh bột.
Hemicellulase được ứng dụng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp thành các hợp chất đợn giản, dễ tiêu hóa.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu để sản xuất COS là chitosan được sản xuất từ vỏ tôm sú theo quy trình của Trần Thị Luyến, với các chỉ tiêu chất lượng như sau:
-Màu sắc: trắng ngà -Trạng thái: mềm mại
-Hàm lượng chất không tan: 1.6% -Độ nhớt: 66.7cp -Độ ẩm: 9.5% -Nitơ tổng quát: 4.05% -Độ deacetyl hóa: 76.25% -Hàm lượng tro: 0.4% Hình 2.1: Vật liệu chitosan dạng bột
Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của Sigma – Mỹ do thầy Tiến sĩ Vũ Ngọc Bội cung cấp.
Enzyme có các đặc điểm sau: -Dạng bột
-Tan trong nước
-Hoạt tính: 1.5 đơn vị hoạt tính/mg
Hình 2.2: Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger
Enzyme Cellulase, sản phẩm của Novozymes, do thầy Tiến sĩ Vũ Ngọc Bội cung cấp.
Enzyme có các đặc điểm sau: -Dạng dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Màu nâu đen
-Hoạt tính: 0.7 đơn vị hoạt tính/ml
Hình 2.3: Enzyme cellulase 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân tích
Nguyên tắc: hoạt tính của enzyme cellulase và hemicellulase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm D-glucosamine của quá trình phân giải chitosan.
- Xác định hàm lượng chất không tan
Nguyên lý: hòa tan COS vào trong nước, sau một thời gian nhất định tiến hành lọc dung dịch, sau đó cân giấy lọc và bã không tan còn lại.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm2.2.2.1. Quy trình dự kiến 2.2.2.1. Quy trình dự kiến
Quy trình dự kiến thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase và hemicellulase như sau:
Hòa tan chitosan bằng acid acetic loãng 2%, sau đó đưa chitosan đi thủy phân bằng hai loại enzyme khác nhau là cellulase và hemicellulase. Trong công đoạn thủy phân cần kiểm soát chặt chẽ các thông số: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân. Sản phẩm thủy phân thu được ở dạng lỏng nên tiến hành kết tủa chúng rồi sấy lạnh, thu được COS dạng rắn.
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình dự kiến thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase và hemicellulase
Từ quy trình hình 2.4 tiến hành nghiên cứu các thông số cần thiết cho quy trình.
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số của quy trình
* Xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân Chitosan bột Hòa tan Thủy phân Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS -Nồng độ enzyme -Nhiệt độ -pH -Thời gian Đun cách thủy
Chitosan bột Hòa tan Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS Thủy phân
[En.] = 1% [En.] = 2% [En.] = 3% [En.] = 4%
Sản phẩm thủy phân
Đánh giá hiệu suất
Xác định nồng độ enzyme thủy phân thích hợp Đun cách thủy
- Nhiệt độ: 370C -Thời gian: 5 ngày -pH = 3.8 (cellulase) và
pH = 4.5 (hemicellulase)
Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
Căn cứ vào công trình nghiên cứu của Aiba và Muraki (1996) và phương pháp thăm dò cổ điển về hai loại enzyme cellulase và hemicellulase, trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân, tôi tiến hành khảo sát nồng độ enzyme từ 1 ÷ 4% so với cơ chất, tại pH 3.8 (đối với enzyme cellulase) và pH 4.5 (đối với enzyme hemicellulase), thời gian là 5 ngày, nhiệt độ thủy phân là 370C. Căn cứ vào hiệu suất của quy trình để chọn ra thông số thủy phân thích hợp.
Chitosan bột Hòa tan Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS - [En.] thích hợp -Thời gian: 4 ngày -pH = 3.8 đối với
cellulase và pH = 4.5 đối với hemicellulase Thủy phân
t0=32±0.50C
Sản phẩm thủy phân
Đánh giá hiệu suất
Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp Đun cách thủy
t0=37±0.50C t0=42±0.50C t0=47±0.50C t0=52±0.50C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Căn cứ vào công trình nghiên cứu của Aiba và Muraki (1996) và phương pháp thăm dò cổ điển về hemicellulase và cellulase, trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân, tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ từ 32 ÷ 520C (320C, 370C, 420C, 470C, 520C), tại pH 3.8 (đối với enzyme cellulase) và pH 4.5 (đối với enzyme hemicellulase), thời gian 4 ngày (100 giờ) và nồng độ enzyme thủy phân thích hợp xác định theo quy trình hình 2.5. Căn cứ vào hiệu suất của quy trình để chọn ra thông số thủy phân thích hợp.
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
* Hóa chất:
Các loại hóa chất được phép sử dụng trong phòng thí nghiệm. * Dụng cụ:
-Pipet, micropipet -Ống đong
-Bình tam giác, phễu lọc -Cốc thủy tinh, bình định mức -Hũ nhựa các loại 100 ml và 250 ml * Thiết bị: -Bể ổn nhiệt -Nhiệt kế -Máy đo pH
-Cân điện tử, tủ lạnh, tủ đông -Máy đo độ nhớt
-Máy đo OD -Máy ly tâm
-Tủ sấy, tủ sấy chân không -Tủ nung
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp cổ điển, sử dụng phần mềm Excel.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME CELLULASE VÀ HEMICELLULASE TRONG THỦY PHÂN CHITOSAN
3.1.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan chitosan
Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 4 mẫu thí nghiệm thủy phân chitosan bằng hai loại enzyme cellulase và hemicellulase ở cùng điều kiện nhiệt độ 370C, thời gian 5 ngày, pH 3.8 đối với enzyme cellulase và pH 4.5 đối với enzyme hemicellulase, tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: 1%, 2%, 3% và 4%. Trong quá trình thủy phân thường xuyên khuấy đảo và đo độ nhớt. Sau khi thủy phân, đem đun sôi dung dịch để vô hoạt enzyme, lọc và điều chỉnh pH về 7 bằng dung dịch kiềm, sử dụng cồn 99.50 để kết tủa oligochitosan. Ly tâm thu kết tủa rồi sấy lạnh ở 300C ta thu được COS dạng vảy. Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 15 18 21 22 43 60 65 132
Thời gian thủy phân (giờ)
Đ ộ n h ớ t (c p ) [Cellulase] 1% [Cellulase] 2% [Cellulase] 3% [Cellulase] 4% [Hemicellulase] 1% [Hemicellulase] 2% [Hemicellulase] 3% [Hemicellulase] 4%
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thay đổi độ nhớt dung dịch