Số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp cổ điển, sử dụng phần mềm Excel.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME CELLULASE VÀ HEMICELLULASE TRONG THỦY PHÂN CHITOSAN
3.1.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan chitosan
Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 4 mẫu thí nghiệm thủy phân chitosan bằng hai loại enzyme cellulase và hemicellulase ở cùng điều kiện nhiệt độ 370C, thời gian 5 ngày, pH 3.8 đối với enzyme cellulase và pH 4.5 đối với enzyme hemicellulase, tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: 1%, 2%, 3% và 4%. Trong quá trình thủy phân thường xuyên khuấy đảo và đo độ nhớt. Sau khi thủy phân, đem đun sôi dung dịch để vô hoạt enzyme, lọc và điều chỉnh pH về 7 bằng dung dịch kiềm, sử dụng cồn 99.50 để kết tủa oligochitosan. Ly tâm thu kết tủa rồi sấy lạnh ở 300C ta thu được COS dạng vảy. Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 15 18 21 22 43 60 65 132
Thời gian thủy phân (giờ)
Đ ộ n h ớ t (c p ) [Cellulase] 1% [Cellulase] 2% [Cellulase] 3% [Cellulase] 4% [Hemicellulase] 1% [Hemicellulase] 2% [Hemicellulase] 3% [Hemicellulase] 4%
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thay đổi độ nhớt dung dịch thủy phân
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 1% 2% 3% 4% Nồng độ enzyme (%) H iệ u s u ấ t th u C OS ( % ) Cellulase Hemicellulase
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thu COS Nhận xét
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy:
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme cellulase:
Từ các kết quả phân tích ở hình 3.1 cho thấy theo thời gian thủy phân, các mẫu thí nghiệm đều có hiện tượng giảm độ nhớt, mẫu bổ sung tỷ lệ enzyme lớn hơn có mức độ giảm độ nhớt nhanh hơn. Như vậy chứng tỏ enzyme cellulase có khả năng thủy phân chitosan.
Đối với mẫu thủy phân chitosan sử dụng enzyme cellulase ở nồng độ 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian thủy phân nhưng mức độ giảm độ nhớt chậm hơn các mẫu sử dụng 2% và 3% enzyme. Vào thời điểm sau 132h thủy phân dịch cơ chất chỉ còn độ nhớt là 9.60cp, giảm 85.61% so với ban đầu và hiệu suất thu oligochitosan (COS) đạt 60.18%. Ở nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian và tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch chitosan chỉ còn 8.88cp, giảm 86.69% so với ban đầu và thấp hơn một chút so với dung dịch thủy phân chitosan dùng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung là 1%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 63.53%. Cũng tương tự như vậy, khi sử dụng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung 3%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm nhanh hơn khi sử dụng tỷ lệ enzyme là 1% và 2%; tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch
chitosan còn là 8.64cp giảm 87.05% so với ban đầu, thấp hơn so với độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan sử dụng tỷ lệ enzyme bổ sung 1% và 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.16%. Tuy vậy, khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung lên 4%, độ nhớt dung dịch cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm chỉ chênh lệch so với khi dùng tỷ lệ enzyme 1% và 2%, so với mẫu sử dụng tỷ lệ enzyme 3% thì mức độ chênh lệch không đáng kể, tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan là 8.52cp thấp hơn không đáng kể so với độ nhớt của mẫu thủy phân dùng 3% enzyme và hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.28%.
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme hemicellulase:
Tương tự như việc sử dụng enzyme cellulase thủy phân chitosan, enzyme hemicellulase cũng có khả năng thủy phân chitosan nhưng mức độ thủy phân chậm hơn thể hiện qua việc theo thời gian độ nhớt của dung dịch thủy phân giảm chậm hơn so với mức độ giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân khi sử dụng enzyme cellulase. Cụ thể với nồng độ enzyme 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân sau 132h thủy phân là 35.90cp – cao hơn rất nhiều so với độ nhớt của mẫu thủy phân bằng cellulase 1%, hiệu suất thu COS tương ứng chỉ đạt 39.94% đương nhiên cũng thấp hơn mẫu thủy phân bằng cellulase 1%. Tương tự như vậy, với nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân chỉ là 34.40cp – cũng cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 42.31%, tất nhiên cũng thấp hơn so với mẫu cellulase 2%. Tại nồng độ enzyme 3%, độ nhớt dung dịch ở thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch là 31.80cp – cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 3%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 53.54%, thấp hơn mẫu cellulase 3%. Tại nồng độ enzyme 4%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân là 31.30cp – cao hơn nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 4%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 54.10%, thấp hơn mẫu cellulase 4%.
Kết quả cho thấy, đối với cả hai loại enzyme thủy phân đã sử dụng, ở nồng độ enzyme sử dụng là 3% và 4% thì hiệu suất thu COS và giá trị độ nhớt của dịch thủy phân giữa 2 nồng độ enzyme sử dụng khác biệt không nhiều nhưng đều chênh
lệch so với khi sử dụng nồng độ enzyme 1% và 2%. Kết quả này cũng cho thấy nồng độ enzyme càng cao thì khả năng thủy phân cơ chất càng mạnh và tất nhiên sản phẩm oligochitosan tạo thành càng nhiều thể hiện qua hiệu suất thu COS tăng và độ nhớt dịch thủy phân càng giảm. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ enzyme đến một mức độ nhất định thì vận tốc phản ứng không thay đổi do không còn dư cơ chất cho phản ứng.
Do vậy để đảm bảo tính kinh tế cho quá trình nghiên cứu, chúng tôi chọn
nồng độ của cả 2 enzyme sử dụng trong thủy phân chitosan là 3% so vớicơ chất.
3.1.2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan
Tiến hành 2 lô thí nghiệm thủy phân chitosan mỗi lô 5 mẫu thí nghiệm thủy phân chitosan ở các nhiệt độ khác nhau (320C, 370C, 420C, 470C, 520C), một lô thủy phân bằng enzyme cellulase và một lô thủy phân bằng enzyme hemicellulase. Các mẫu thí nghiệm đều thủy phân ở cùng điều kiện: nồng độ enzyme 3%, thời gian 4 ngày, pH 3.8 đối với enzyme cellulase và pH 4.5 đối với enzyme hemicellulase, các điều kiện nhiệt độ khác nhau Trong quá trình thủy phân thường xuyên khuấy đảo, đo độ nhớt dung dịch thủy phân, kiểm tra nhiệt độ và pH để đảm bảo tính ổn định trong quá trình thủy phân. Sau thủy phân đun cách thủy để vô hoạt enzyme, lọc và điều chỉnh pH về trung tính bằng kiềm rồi sử dụng cồn 99.50 để kết tủa, sau đó ly tâm rồi sấy lạnh ở 300C ta thu được COS dạng vảy. Tiến hành đánh giá độ nhớt và hiệu suất thu hồi COS theo thời gian thủy phân. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.3 và 3.4.
0 10 20 30 40 50 60 70 5 22 27 46 48 51 70 75 94 100
Thời gian thủy phân (giờ)
Đ ộ n h ớ t (c p ) Cellulase 32oC Cellulase 37oC Cellulase 42oC Cellulase 47oC Cellulase 52oC Hemicellulase 32oC Hemicellulase 37oC Hemicellulase 42oC Hemicellulase 47oC Hemicellulase 52oC
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến sự thay đổi độ nhớt dung dịch thủy phân 0 20 40 60 80 100
32oC 37oC 42oC 47oC 52oC
Nhiệt độ thủy phân (oC)
H iệ u s u ấ t th u C O S ( % ) Cellulase Hemicellulase
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu COS
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.3 và 3.4 cho thấy:
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme cellulase:
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.3 cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến hoạt tính của enzyme cellulase. Cụ thể tại nhiệt độ 320C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, đặc biệt là trong 22h đầu, giá trị độ nhớt
sau 100h thủy phân là 18.20cp, hiệu suất thu COS đạt 62.41%; tại nhiệt độ 370C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, giá trị độ nhớt sau 100h thủy phân là 8.64cp, thấp hơn so với mẫu cellulase 320C, hiệu suất thu COS đạt 65.09%, cao hơn so với mẫu cellulase 320C. Tại nhiệt độ 420C, độ nhớt của dung dịch giảm mạnh theo thời gian thủy phân, đến 48h thì không thể đo được độ nhớt dung dịch, lượng cơ chất chitosan đã bị cắt mạch hoàn toàn, hiệu suất thu COS đạt 81.72%, cao hơn so với mẫu cellulase 370C. Tại nhiệt độ 470C, độ nhớt của dung dịch giảm mạnh theo thời gian thủy phân, đến 48h thì không thể đo được độ nhớt dung dịch, lượng cơ chất chitosan đã bị cắt mạch hoàn toàn, hiệu suất thu COS đạt 83.57%, cao hơn so với mẫu cellulase 420C. Tại nhiệt độ 520C, độ nhớt của dung dịch giảm mạnh theo thời gian thủy phân, đến 48h thì không thể đo được độ nhớt dung dịch, lượng cơ chất chitosan đã bị cắt mạch hoàn toàn, hiệu suất thu COS đạt 82.41%, thấp hơn so với mẫu cellulase 470C.
+ Đối với mẫu thủy phân bằng hemicellulase:
Tương tự như quá trình thủy phân bằng enzyme cellulase, nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến hoạt tính của enzyme hemicellulase. Cụ thể tại nhiệt độ 320C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, sau 100h thủy phân độ nhớt dung dịch là 43.6cp, hiệu suất thu COS đạt 45.11%, thấp hơn so với mẫu cellulase 320C.
Tại nhiệt độ 370C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, sau 100h thủy phân độ nhớt dung dịch là 34.30cp, hiệu suất thu COS đạt 52.30%, cao hơn so với mẫu hemicellulase 320C và thấp hơn so với mẫu cellulase 370C.
Tại nhiệt độ 420C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, sau 100h thủy phân độ nhớt dung dịch là 16.5cp, hiệu suất thu COS đạt 62.05%, cao hơn so với mẫu hemicellulase 370C và thấp hơn so với mẫu cellulase 420C.
Tại nhiệt độ 470C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, sau 100h thủy phân độ nhớt dung dịch là 18.3cp, hiệu suất thu COS đạt 61.59%, cao hơn so với mẫu hemicellulase 420C và thấp hơn so với mẫu cellulase 470C.
Tại nhiệt độ 520C, độ nhớt của dung dịch giảm dần theo thời gian thủy phân, sau 100h thủy phân độ nhớt dung dịch là 26.60cp, hiệu suất thu COS đạt 56.33%, thấp hơn so với mẫu hemicellulase 470C và thấp hơn so với mẫu cellulase 520C.
Kết quả trên cho thấy, đối với enzyme cellulase, ở nhiệt độ thủy phân 470C và 520C hiệu suất thu COS không chênh lệch nhau nhiều, còn đối với enzyme hemicellulase thì là 420C và 470C. Tuy nhiên, nhiệt độ thủy phân càng cao thì màu sắc của dung dịch thủy phân cũng như COS thu được càng sẫm, không đẹp mắt. Vì vậy, chúng tôi chọn 470C là nhiệt độ thích hợp để thủy phân chitosan bằng enzyme
cellulase và 420C là nhiệt độ thích hợp để thủy phân chitosan bằng enzyme
hemicellulase.
3.2. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN CHITOSAN BẰNG ENZYME CELLULASE VÀ HEMICELLULASE ENZYME CELLULASE VÀ HEMICELLULASE
3.2.1. Đề xuất quy trình thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase
Qua quá trình nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thủy phân chitosan để sản xuất oligochitosan bằng enzyme cellulase như sau:
Hình 3.5: Quy trình thủy phân chitosan bằng enzyme cellulase * Giải thích quy trình:
Nguyên liệu để sản xuất oligochitosan là chitosan được sản xuất theo quy trình của Trần Thị Luyến, sau đó xay thành dạng bột mịn. Hòa tan chitosan trong
Chitosan bột Hòa tan Thủy phân Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS Cellulase
-[En.] 3% so với cơ chất -pH = 3.8
-t = 470C -Thời gian 48h Đun cách thủy
dung dịch đệm Britton pH 3.8, lắc đều cho đến khi chitosan tan hoàn toàn, độ nhớt dung dịch chitosan thu được là 66.7cp, điều chỉnh lại pH dung dịch về 3.8.
Bổ sung enzyme thủy phân cellulase vào dung dịch chitosan để bắt đầu quá trình thủy phân, tỷ lệ enzyme 3% so với cơ chất, thời gian thủy phân 48h, nhiệt độ 470C. Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch của chitosan, nó quyết định đến hiệu suất cũng như chất lượng của oligochitosan thu được. Thường xuyên khuấy đảo để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất. Đo độ nhớt và pH của dung dịch trong suốt quá trình thủy phân, cứ cách 5h thủy phân lại đo một lần.
Dung dịch sau 48h thủy phân được đun sôi cách thủy nhằm đình chỉ hoạt động của enzyme. Sau đó tiến hành lọc nóng dung dịch bằng giấy lọc wattman đã được sấy đến khối lượng không đổi. Lợi dụng tính chất của COS là chúng có khả năng hòa tan còn chitosan thì không nên ta tiến hành lọc dung dịch sau thủy phân. Phần bị giữ lại trên giấy lọc là tạp chất, cặn bẩn cùng phần chitosan chưa được thủy phân hết, phần dung dịch được lọc là dung dịch COS.
Tiến hành điều chỉnh pH dung dịch sau lọc về 7 bằng dung dịch kiềm nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình kết tủa thu COS. Cho dung dịch đó vào tủ lạnh trong 12h và tiếp tục để vào tủ đông trong 4h với mục đích làm tăng hiệu quả quá trình lắng thu kết tủa, sau đó mang đi ly tâm với tốc độ 3400 v/p, thời gian 15 phút, thu được kết tủa COS đã tách cồn. Do COS thu được còn ẩm cao nên phải sấy chân không ở nhiệt độ 300C đến khô rồi tiến hành thu hồi mẫu.
3.2.2. Đề xuất quy trình thủy phân chitosan bằng enzyme hemicellulase
Qua quá trình nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thủy phân chitosan để sản xuất oligochitosan bằng enzyme hemicellulase như sau:
Hình 3.6: Quy trình hoàn thiện thủy phân chitosan bằng enzyme hemicellulase * Giải thích quy trình:
Nguyên liệu để sản xuất oligochitosan là chitosan được sản xuất theo quy trình của Trần Thị Luyến, sau đó xay thành dạng bột mịn. Hòa tan chitosan trong
Chitosan bột Hòa tan Thủy phân Lọc Điều chỉnh pH Kết tủa Làm lạnh Làm đông Ly tâm Sấy lạnh COS Hemicellulase
-[En.] 3% so với cơ chất -pH = 4.5
-t = 420C
-Thời gian 100h Đun cách thủy
dung dịch đệm Britton pH 4.5, lắc đều cho đến khi chitosan tan hoàn toàn, độ nhớt dung dịch chitosan thu được là 66.7cp, điều chỉnh lại pH dung dịch về 4.5.
Bổ sung enzyme thủy phân cellulase vào dung dịch chitosan để bắt đầu quá trình thủy phân, tỷ lệ enzyme 3% so với cơ chất, thời gian thủy phân 100h, nhiệt độ 420C. Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch của chitosan, nó quyết định đến hiệu suất cũng như chất lượng của oligochitosan thu được. Thường xuyên khuấy đảo để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất. Đo độ nhớt và pH của dung dịch trong suốt quá trình thủy phân, cứ cách 5h thủy phân lại đo một lần.
Dung dịch sau 100h thủy phân được đun sôi cách thủy nhằm đình chỉ hoạt động của enzyme. Sau đó tiến hành lọc nóng dung dịch bằng giấy lọc wattman đã được sấy đến khối lượng không đổi. Lợi dụng tính chất của COS là chúng có khả năng hòa tan còn chitosan thì không nên ta tiến hành lọc dung dịch sau thủy phân. Phần bị giữ lại trên giấy lọc là tạp chất, cặn bẩn cùng phần chitosan chưa được thủy phân hết, phần dung dịch được lọc là dung dịch COS.
Tiến hành điều chỉnh pH dung dịch sau lọc về 7 bằng dung dịch kiềm nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình kết tủa thu COS. Cho dung dịch đó vào tủ lạnh trong 12h và tiếp tục để vào tủ đông trong 4h với mục đích làm tăng hiệu quả quá