3.1.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan chitosan
Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 4 mẫu thí nghiệm thủy phân chitosan bằng hai loại enzyme cellulase và hemicellulase ở cùng điều kiện nhiệt độ 370C, thời gian 5 ngày, pH 3.8 đối với enzyme cellulase và pH 4.5 đối với enzyme hemicellulase, tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: 1%, 2%, 3% và 4%. Trong quá trình thủy phân thường xuyên khuấy đảo và đo độ nhớt. Sau khi thủy phân, đem đun sôi dung dịch để vô hoạt enzyme, lọc và điều chỉnh pH về 7 bằng dung dịch kiềm, sử dụng cồn 99.50 để kết tủa oligochitosan. Ly tâm thu kết tủa rồi sấy lạnh ở 300C ta thu được COS dạng vảy. Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi COS. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 15 18 21 22 43 60 65 132
Thời gian thủy phân (giờ)
Đ ộ n h ớ t (c p ) [Cellulase] 1% [Cellulase] 2% [Cellulase] 3% [Cellulase] 4% [Hemicellulase] 1% [Hemicellulase] 2% [Hemicellulase] 3% [Hemicellulase] 4%
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thay đổi độ nhớt dung dịch thủy phân
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 1% 2% 3% 4% Nồng độ enzyme (%) H iệ u s u ấ t th u C OS ( % ) Cellulase Hemicellulase
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thu COS Nhận xét
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy:
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme cellulase:
Từ các kết quả phân tích ở hình 3.1 cho thấy theo thời gian thủy phân, các mẫu thí nghiệm đều có hiện tượng giảm độ nhớt, mẫu bổ sung tỷ lệ enzyme lớn hơn có mức độ giảm độ nhớt nhanh hơn. Như vậy chứng tỏ enzyme cellulase có khả năng thủy phân chitosan.
Đối với mẫu thủy phân chitosan sử dụng enzyme cellulase ở nồng độ 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian thủy phân nhưng mức độ giảm độ nhớt chậm hơn các mẫu sử dụng 2% và 3% enzyme. Vào thời điểm sau 132h thủy phân dịch cơ chất chỉ còn độ nhớt là 9.60cp, giảm 85.61% so với ban đầu và hiệu suất thu oligochitosan (COS) đạt 60.18%. Ở nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian và tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch chitosan chỉ còn 8.88cp, giảm 86.69% so với ban đầu và thấp hơn một chút so với dung dịch thủy phân chitosan dùng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung là 1%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 63.53%. Cũng tương tự như vậy, khi sử dụng enzyme cellulase với tỷ lệ bổ sung 3%, độ nhớt dung dịch thủy phân cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm nhanh hơn khi sử dụng tỷ lệ enzyme là 1% và 2%; tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch
chitosan còn là 8.64cp giảm 87.05% so với ban đầu, thấp hơn so với độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan sử dụng tỷ lệ enzyme bổ sung 1% và 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.16%. Tuy vậy, khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung lên 4%, độ nhớt dung dịch cũng giảm dần theo thời gian nhưng mức độ giảm chỉ chênh lệch so với khi dùng tỷ lệ enzyme 1% và 2%, so với mẫu sử dụng tỷ lệ enzyme 3% thì mức độ chênh lệch không đáng kể, tại thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt của dung dịch thủy phân chitosan là 8.52cp thấp hơn không đáng kể so với độ nhớt của mẫu thủy phân dùng 3% enzyme và hiệu suất thu COS tương ứng đạt 64.28%.
+ Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme hemicellulase:
Tương tự như việc sử dụng enzyme cellulase thủy phân chitosan, enzyme hemicellulase cũng có khả năng thủy phân chitosan nhưng mức độ thủy phân chậm hơn thể hiện qua việc theo thời gian độ nhớt của dung dịch thủy phân giảm chậm hơn so với mức độ giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân khi sử dụng enzyme cellulase. Cụ thể với nồng độ enzyme 1%, độ nhớt của dung dịch thủy phân sau 132h thủy phân là 35.90cp – cao hơn rất nhiều so với độ nhớt của mẫu thủy phân bằng cellulase 1%, hiệu suất thu COS tương ứng chỉ đạt 39.94% đương nhiên cũng thấp hơn mẫu thủy phân bằng cellulase 1%. Tương tự như vậy, với nồng độ enzyme 2%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân chỉ là 34.40cp – cũng cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 2%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 42.31%, tất nhiên cũng thấp hơn so với mẫu cellulase 2%. Tại nồng độ enzyme 3%, độ nhớt dung dịch ở thời điểm sau 132h thủy phân độ nhớt dung dịch là 31.80cp – cao hơn rất nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 3%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 53.54%, thấp hơn mẫu cellulase 3%. Tại nồng độ enzyme 4%, độ nhớt dung dịch thủy phân ở thời điểm sau 132h thủy phân là 31.30cp – cao hơn nhiều so với mẫu thủy phân bằng cellulase 4%, hiệu suất thu COS tương ứng đạt 54.10%, thấp hơn mẫu cellulase 4%.
Kết quả cho thấy, đối với cả hai loại enzyme thủy phân đã sử dụng, ở nồng độ enzyme sử dụng là 3% và 4% thì hiệu suất thu COS và giá trị độ nhớt của dịch thủy phân giữa 2 nồng độ enzyme sử dụng khác biệt không nhiều nhưng đều chênh
lệch so với khi sử dụng nồng độ enzyme 1% và 2%. Kết quả này cũng cho thấy nồng độ enzyme càng cao thì khả năng thủy phân cơ chất càng mạnh và tất nhiên sản phẩm oligochitosan tạo thành càng nhiều thể hiện qua hiệu suất thu COS tăng và độ nhớt dịch thủy phân càng giảm. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ enzyme đến một mức độ nhất định thì vận tốc phản ứng không thay đổi do không còn dư cơ chất cho phản ứng.
Do vậy để đảm bảo tính kinh tế cho quá trình nghiên cứu, chúng tôi chọn
nồng độ của cả 2 enzyme sử dụng trong thủy phân chitosan là 3% so vớicơ chất.