Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa- 123docz.net

khử gốc tự do DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002).

a. Cách tiến hành:

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch chất chống oxy hóa BHT, 1ml methanol, 1ml dung dịch DPPH 100µM và cuối cùng cho nước cất vào để thể tích mỗi ống đạt 4ml. Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra trong bóng tối 30 phút. Sau 30 phút phản ứng, đem hỗn hợp đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm trên quang phổ kế UV/VIS. Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 1ml chất chống oxy hóa bằng dung môi hòa tan chất chống oxy hóa. Trong thí nghiệm này autozero bằng nước cất. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.

b. Cách tính kết quả:

Khả năng khử gốc tự do DPPH được tính dựa vào phương trình đường chuẩn DPPH.

2.2.3.2. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử

Năng lực khử của BHT được phân tích theo phương pháp của Oyaizu (1986). a. Cách tiến hành:

Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy kín hỗn hợp phản ứng gồm 0,5ml K3Fe(CN)6 1%, 0.5ml dung dịch chất chống oxy hóa BHT và cho dung dịch đệm phosphate pH = 6,6 để đủ 1.5ml. Trộn đều hỗn hợp rồi đem ủ ở 50oC trong 20 phút. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 0,5ml CCl3COOH 10%, 2ml nước cất và 0,4ml FeCl3 0,1%. Trộn đều hỗn hợp rồi đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm trên quang phổ kế UV/VIS. Khi làm thí nghiệm này dùng mẫu trắng để autozero, mẫu trắng được chuẩn bị như sau: Cho 0.8ml dung dịch đệm (pH = 6,6) và 0,5ml K3Fe(CN)6 1% vào ống nghiệm, 0,2ml nước cất rồi đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm trên quang phổ kế UV/VIS. b. Cách tính kết quả:

Tổng năng lực khử được xác định dựa vào độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm. Hỗn hợp phản ứng có độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn.

2.2.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide

Khả năng khử hydroperoxide của BHT được phân tích theo phương pháp của Nabavi và cộng sự (2009).

a. Cách tiến hành:

Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml dung dịch chất chống oxy hóa BHT. Sau đó cho vào 2,5ml H2O2 pha trong đệm phosphate pH = 7,4, sau đó cho tiếp dung dịch đệm phosphate pH = 7,4 sao cho mỗi ống nghiệm đủ 4ml. Đối với thí nghiệm này cần autozero đối với từng nồng độ. Mẫu autozero của mẫu BHT tương ứng với từng nồng độ gồm: 0,5ml mẫu + 3,5ml dung dịch đệm phosphate pH = 7,4. Trộn đều hỗn hợp để phản ứng xảy ra trong 10 phút ở

nhiệt độ thường. Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 0,5ml chất chống oxy hóa bằng dung môi methanol. Mẫu autozero của mẫu đối chứng gồm: 0,5ml methanol + 3.5ml dung dịch đệm phosphate pH = 7,4, để 10 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 230nm trên quang phổ kế UV/VIS.

b. Cách tính kết quả:

[H2O2] bị khử =[(Ao-A)/Ao]*100 (%)

Trong đó: Ao: Giá trị hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 230nm. A: Giá trị hấp thụ của mẫu thí nghiệm ở bước sóng 230nm.

2.2.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2

Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 được tiến hành theo phương pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013).

a. Cách tiến hành:

Cho vào ống nghiệm 40µl metmyoglobin 100µM và 40µl dung dịch H2O2100µM, lắc đều trong 3 phút. Tiếp tục cho vào mỗi ống 80µl dung dịch EPA pha trong tween. Sau đó cho vào mỗi ống 40µl chất chống oxy hóa BHT. Lắc đều rồi đem đi ủ ở 370C trong 30 phút. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0,3ml dung dịch KCl 1,15%, 4,5ml dung dịch H3PO4 1%, 1ml thiobarbituric (TBARS) 0.6%. Đem hỗn hợp phản ứng đun nóng ở 950C trong 45 phút trong bể ổn nhiệt. Trong thí nghiệm này dùng dung dịch H3PO4 1% để chiết TBARS, vì nếu dùng butanol thì mẫu hơi đục và không trong bằng khi dùng H3PO4 1%. Và để rút ngắn công đoạn nên cho 4ml H3PO4 1% để chiết TBARS vào trong công đoạn trước khi đem ủ 950C trong 45 phút. Lấy ra làm nguội ở nhiệt độ phòng hoặc để dưới vòi nước chảy và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm.

Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 40µl chất chống oxy hóa bằng 40µl dung môi dùng để hòa tan chất chống oxy hóa là aceton. Đối với thí nghiệm này thì autozero bằng nước cất.

b. Cách tính kết quả:

Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535nm.

A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm.

2.2.3.5. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2

Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 được tiến hành theo phương pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013).

a. Cách tiến hành:

Cho vào ống nghiệm 40µl FeCl2 50µM và 40µl dung dịch H2O2100µM, lắc đều trong 3 phút. Tiếp tục cho vào mỗi ống 80µl dung dịch EPA pha trong tween. Sau đó cho vào mỗi ống 40µl chất chống oxy hóa BHT. Lắc đều rồi đem đi ủ ở 370C trong 30 phút. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0,3ml dung dịch KCl 1,15%, 4,5ml dung dịch H3PO4 1%, 1ml thiobarbituric (TBARS) 0.6%. Đem hỗn hợp phản ứng đun nóng ở 950C trong 45 phút trong bể ổn nhiệt. Trong thí nghiệm này dùng dung dịch H3PO4 1% để chiết TBARS, vì nếu dùng butanol thì mẫu hơi đục và không trong bằng khi dùng H3PO4 1%. Và để rút ngắn công đoạn nên cho 4ml H3PO4 1% để chiết TBARS vào trong công đoạn trước khi đem ủ 950C trong 45 phút. Lấy ra làm nguội ở nhiệt độ phòng hoặc để dưới vòi nước chảy và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm.

b. Cách tính kết quả:

Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535nm.

A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05) của các giá trị trung bình sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2

Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2được trình bày trên đồ thị hình 3.1.

Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2

Từ kết quả trên đồ thị hình 3.1 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tăng theo nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng. BHT là chất chống oxy hóa với cơ chế như sau:

Ban đầu phản ứng giữa metmyoglobin và H2O2, tạo ra gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb), gốc này kích thích oxy hóa lipid xảy ra nhanh hơn thường lệ. Khi đó lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy tạo thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm.

0 10 20 30 40 50 60 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ BHT (g/ml) H o ạ t tí n h ch ố n g o x y h ó a t r o n g h ệ li p id /m y o g lo b in /H 2 O 2 ( % )

Khi cho chất chống oxy hóa BHT vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid bằng cách khử gốc tự do nghĩa là chúng sẽ cho đi electron để hình thành cặp electron mới với electron chưa ghép đôi của gốc tự do. Đồng thời nó sẽ giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do, tức là sẽ khử hydroperoxide vì đây là sản phẩm đầu tiên của quá trình khởi tạo, nếu không khử nó thì sẽ tạo ra gốc tự do hydroxyl và làm tăng sự hình thành các gốc tự do khác. Khi đó hàm lượng MDA sẽ giảm nên khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) vào thì nó bắt màu ít hơn nên cường độ màu đỏ giảm đi. Điều đó chứng tỏ, dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.

Vì vậy, khi cho BHT vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid, nên cường độ màu đỏ của hỗn hợp sau phản ứng giảm đi. Nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng càng cao thì ức chế oxy hóa lipid càng mạnh nên cường độ màu đỏ của hỗn hợp sau phản ứng càng thấp.

3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2

Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2được trình bày trên đồ thị hình 3.2.

Hình 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa lipid của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2

0 10 20 30 40 50 60 70 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ BHT (g/ml) H o ạ t tí n h c h ố n g o x y h ó a t r o n g h ệ li p id /F e C l2 /H 2 O2 ( % )

Từ kết quả trên đồ thị hình 3.2 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tăng theo nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng. BHT là chất chống oxy hóa với cơ chế như sau:

Ban đầu phản ứng giữa FeCl2 và H2O2, tạo ra gốc tự do hydroxyl (OH*), gốc này kích thích oxy hóa lipid xảy ra nhanh hơn thường lệ. Đây là phản ứng Fenton khá phổ biến được sử dụng trong xử lý nước thải nhờ vào khả năng phản ứng của gốc tự do hydroxyl với các hợp chất hữu cơ. Nói chung, về cơ chế chống oxy hóa cũng tương tự như phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của BHT dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2. Nghĩa là khi cho chất chống oxy hóa BHT vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid bằng cách khử gốc tự do nghĩa là chúng sẽ cho đi electron để hình thành cặp electron mới với electron chưa ghép đôi của gốc tự do. Đồng thời nó sẽ giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do, tức là sẽ khử hydroperoxide vì đây là sản phẩm đầu tiên của giai đoạn khởi tạo trong quá trình oxy hóa lipid, nếu không khử nó thì hydroperoxide sẽ phân hủy tạo ra gốc tự do hydroxyl và định hướng cho sự hình thành các gốc tự do khác. Khi đó hàm lượng MDA sẽ giảm nên khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) vào thì nó bắt màu ít hơn nên cường độ màu đỏ giảm đi. Nghĩa là dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.

3.3. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện nên được áp dụng phổ biến nhất hiện nay. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phản ánh hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH. Kết quả phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT được thể hiện trên đồ thị hình 3.3.

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 Nồng độ BHT (g/ml ) N ồ n g đ ộ D P P H b ị k h ử ( m M ) Hình 3.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT

Từ kết quả trên đồ thị hình 3.3 cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT phụ thuộc vào nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng càng lớn thì khả năng khử DPPH càng cao. Điều này có thể giải thích như sau: DPPH là gốc tự do, bản thân gốc tự do này là phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi. Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học. DPPH có màu tím nhờ vào electron của nitơ chưa ghép đôi. Trong khi đó, BHT là chất chống oxy hóa và nó sẵn sàng góp 1 electron ghép đôi với electron ở lớp ngoài cùng của gốc tự do DPPH tạo nên phức bền làm giảm màu tím của hỗn hợp phản ứng. Khi nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng càng lớn thì khả năng nhường electron để ghép đôi với electron độc thân của nitơ trong phân tử gốc tự do DPPH cao nên cường độ màu tím giảm đi càng nhiều. Vì vậy, nồng độ BHT càng lớn thì khả năng khử gốc DPPH càng mạnh.

3.4. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào tổng năng lực khử

Bên cạnh phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH, đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử cũng là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và được áp dụng khá phổ biến. Cũng như phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH, phương pháp này chỉ phản ánh hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp thông qua khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ trong hỗn hợp phản ứng. Kết quả phân tích tổng năng lực khử của BHT được thể hiện trên đồ thị hình 3.4. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ BHT (g/ml) Đ ộ h ấ p t h ụ ở b ư ớ c s ó n g 7 0 0 n m Hình 3.4. Tổng năng lực khử của BHT

Từ kết quả trên hình 3.4 cho thấy tổng năng lực khử của BHT phụ thuộc vào nồng độ. Nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn. Điều này có thể giải thích như sau:

BHT là chất chống oxy hóa có khả năng nhường 1 electron để ghép đôi, còn ion Fe3+ có xu hướng nhận electron để chuyển về ion Fe2+. Nghĩa là BHT khử K3Fe(CN)6 thành K4Fe(CN)6, hay nói cách khác ion Fe3+ trong phân

tử K3Fe(CN)6 bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử K4Fe(CN)6 làm hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu xanh. Cường độ màu xanh tỉ lệ thuận với hàm lượng K4Fe(CN)6 trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, khi nồng độ BHT trong hỗn hợp phản ứng càng cao thì tổng năng lượng khử càng lớn.

3.5. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử H2O2

Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử H2O2 cũng là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và được áp dụng phổ biến. Tuy nhiên, H2O2 là chất oxy hóa mạnh, kém bền dễ bị phân hủy nên nồng độ dung dịch H2O2 thường không ổn định. Điều này có thể dẫn đến kết quả phân tích không chính xác nếu không có biện pháp kiểm soát nồng độ H2O2 trong quá trình phân tích. Kết quả phân tích khả năng khử H2O2 của BHT được trình bày trên đồ thị hình 3.5. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Nồng độ BHT (g/ml ) N ồ n g đ ộ H 2 O2 b ị k h ử ( % ) Hình 3.5. Khả năng khử H2O2 của BHT

Từ kết quả trên hình 3.5 cho thấy khả năng khử H2O2 của BHT phụ