1.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Đây là phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do. Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định. Do đó phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa. Khả năng khử gốc tự do DPPH của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [6].
Nguyên tắc:
DPPH là một gốc tự do, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi. Sự làm giảm màu tím đặc trưng của DPPH là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa BHT, nó sẽ bị khử thành 2,2- diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH-H) do trung hòa gốc DPPH bằng cách cho đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt. Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét gốc tự do của chất chống oxy hóa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH.
Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa.
Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH 1.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu (1985) [7].
Nguyên tắc:
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chất. Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính oxy hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid.
X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] Hay X + [Fe(CN)6]3+ [Fe(CN)6]4+
Khi bổ sung Fe3+, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức (K4[Fe(CN)6]). Phức hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm.
4Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4+ K4[Fe(CN)6] (màu xanh)
Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành. Do đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu khử càng cao.
1.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2
Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự (2010) [4].
Nguyên tắc:
Hệ tác nhân Fenton là một hỗn hợp gồm các ion sắt hóa trị 2 (thông thường dùng muối FeCl2) và hydroperoxit (H2O2), chúng tác dụng với nhau sinh ra gốc tự do •OH, còn Fe2+ bị oxy hóa thành Fe3+ theo phản ứng:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + *OH + OH – (3.3) (k=63l.mol-1s-1)
Phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton do ông là người đầu tiên đã mô tả quá trình này năm 1894. Phản ứng Fenton đã tiếp tục được nghiên cứu bởi nhiều tác giả sau này, các nghiên cứu này cho thấy ngoài phản ứng trên là phản ứng chính thì trong quá trình Fenton còn có xảy ra các phản ứng khác. Tổng hợp lại bao gồm: Fe2+ + H2O2 Fe3++ *OH + OH – (3.4) Fe3+ + H2O2 Fe2++ *HO2 + H + (3.5) * OH + Fe2+ OH - + Fe3+ (3.6) * OH + H2O2 H2O + *HO2 (3.7) Fe2++ *HO2 Fe3+ + HO2 - (3.8) Fe3++ *HO2 Fe2+ +O2 + H+ (3.9)
Những phản ứng trên chứng tỏ tác dụng của sắt đóng vai trò là chất xúc tác. Theo Walling (1975) gốc tự do •OH sinh ra có khả năng phản ứng với Fe2+ và H2O2 nhưng quan trọng nhất là khả năng phản ứng với nhiều chất hữu cơ (RH) tạo thành các gốc hữu cơ có khả năng phản ứng cao, từ đó sẽ phát triển tiếp tục theo kiểu dây chuỗi:
* OH + Fe2+ OH - + Fe3+ (3.10) * OH + H2O2 H2O + *HO2 (3.11) * OH + RH *R + H2O (3.12) Ứng dụng:
Mô hình Fenton nổi lên trong những năm gần đây như một loại công nghệ cao có tầm quan trọng trong việc đẩy mạnh các quá trình oxy hóa, giúp phân huỷ nhiều loại hợp chất hữu cơ khó phân huỷ như hydrocacbon halogen hóa, hydrocacbon aromatic, các hoá chất bảo vệ thực vật, dioxin, furan, thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt… Hay mô hình này áp dụng chủ yếu trong việc xử lý các vấn đề về môi trường là chủ yếu.
1.4.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide khử hydroperoxide
Khả năng khử hydroperoxide của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Nabavi và cộng sự (2008) [5, 6].
Nguyên lý:
Khả năng khử hydroperoxide của BHT có thể là do nó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa. Vì vậy khả năng khử hydroperoxide cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa một chất.
H2O2 xuất hiện trong tự nhiên với hàm lượng thấp, có trong không khí, nước, cơ thể con người, thực vật, vi sinh vật, thực phẩm và nước uống. Nó được sử dụng rộng rãi như một chất tẩy trắng trong ngành công nghiệp dêt, sản xuất giấy. Con người tiếp xúc với H2O2 thông qua môi trường được ước tính là 0.28 mg/kg/ngày. Hydroperoxide thâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường hô hấp, mắt và da. Trong cơ thể, hydroperoxide bị phân hủy tạo ra oxy và nước và điều này có thể tạo ra gốc tự do hydroxyl. Mà gốc này có làm kích hoạt oxy hóa lipid, làm phá hoại cấu trúc ADN. Vì vậy, bản thân H2O2 không độc nhưng có thể gây độc tế bào bởi tạo ra các gốc hydroxyl trong tế bào. Như vậy, loại bỏ H2O2 là rất quan trọng trong suốt hệ thống thực phẩm.
1.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2
Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự, 2010 [4].
Nguyên lý:
Trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid của chất chống oxy hóa.
1.4.6. Phương pháp ORAC
Phương pháp này đo các chất chống oxy hóa ức chế gốc peroxyl, phản ứng của các gốc chống oxy hóa với lipid trong thực phẩm và trong hệ thống sinh lý học. Phương pháp này phát hiện các chất chống oxy hóa phân cực và kém phân cực bằng cách thay đổi dung môi.
Nguyên lý: Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxyl. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt định. Khi fluorescein bị oxy hóa , cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất chống oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là xác định được có hay không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều kiện rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.
Hình 1.12. Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 1.4.7. Phương pháp TRAP
Phương pháp này thường được sử dụng để đo khả năng chống oxy
hóa in vivo của huyết tương hoặc huyết thanh vì phương pháp này đo các chất
chống oxy hóa không phải là enzym như glutathion, acid ascorbic, tocopherol…
Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2'- azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn
là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.
1.4.8. Phương pháp FRAP
Phương pháp FRAP được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử trong huyết tương [27], [28] nhưng cũng được sử dụng để phân tích các chất chống oxy hóa trong thực vật.
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+- TPTZ[2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (butylated hydroxyl toluene). Khi cho phức Fe3+- TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ. Tác động chống oxy hóa được đánh giá bởi sự tăng cường độ màu của phức Fe (II)-TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.
1.4.9. Phương pháp FTC
Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hỗn hợp lipid của chất chống oxy hóa
Trong khảo nghiệm này, hydroperoxide sinh ra bởi acid oleic thêm vào hỗn hợp phản ứng bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ kèm trong thời gian thử nghiệm được đo gián tiếp. Sắt (II) clorua và ammonium thiocyanate phản ứng với nhau để tạo ra ferric thiocyanate (màu đỏ) nhờ hydroperoxide.
Hỗn hợp thí nghiệm gồm có: 0,1 mL mẫu chất chống oxy hóa, 1 mL acid oleic 200 mg/mL, 5 mL đệm phosphat 0,04 M; 5 mL EtOH 75%, 2 mL nước cất và giữ ở 45°C, trong bóng tối. Hỗn hợp này cũng được chuẩn bị thêm phản ứng không có acid oleic để làm đối chứng. . Sau khi mẫu có màu đỏ, độ hấp thụ được đo ngay lập tức ở bước sóng 500 nm (Trần Thị Việt Hoa et al., 2007). Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ về vạch 0.
1.4.10. Phương pháp TEAC
CationABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thụ 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối.
1.4.11. Phương pháp tổng năng lực khử
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6
thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành K3[Fe(CN)6] (xanh Pruss). Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690nm.
1.4.12. Phương pháp TAC (Determination of Total Antioxidant Capacity)
Tổng hoạt động chống oxy hóa của I. griffithii được xác định theo phương pháp của Kareti và cộng sự [12]. 300 μg/ml của mẫu chiết được kết hợp với 3ml thuốc thử molybdenum (50ml acid sulfuric 0.6M, 50ml natri phosphate 28Mm và 50ml ammonium molybdate 4Mm). Đem hỗn hợp ủ ở
950C trong 90 phút. Sau đó đem làm lạnh đến nhiệt độ phòng, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 695nm.
1.4.13. Phương pháp DMPD (N, N-dimethyl-p-phenylene diamindihydrochloride)
Phương pháp dựa trên sự giảm màu sắc của DMPD trong dung dịch đệm acetate và ferric chloride. Và độ hấp thụ của DMPD được đo ở bước sóng 505nm. Hoạt động chống oxy hóa của rượu được đo bằng phương pháp này. Hoạt độ chống oxy hóa được thể hiện phần trăm giảm của DMPD.
1.4.14. Phương pháp Phospho molybdenum
Nó là một phương pháp quang phổ cho phép định lượng năng lực chống oxy hóa, thông qua sự hình thành của phức hợp phospho molypden. Các khảo nghiệm được dựa trên việc giảm Mo (VI) thành Mo (V) của mẫu phân tích và hình thành màu xanh của phức hợp phosphate Mo (V) ở pH axit. (Kanner,. Et.al, 1994).
1.4.15. Khảo nghiệm Conjugated diene.
Nguyên tắc của phương pháp này là trong quá trình oxy hóa acid linoleic, các liên kết đôi được chuyển đổi thành liên kết đôi liên hợp, được đặc trưng bởi sự hấp thụ tia cực tím mạnh tại bước sóng 234 nm.
Tóm tắt các đặc điểm các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa
STT Phương
pháp
Đặc điểm phương pháp
Trang thiết bị Tính khả thi trong các hệ thống sinh học 1 ORAC + + + + + + 2 TRAP - - - - - + + + 3 FRAP + + + + + + - 4 TEAC + + - 5 DPPH + + - 6 FTC + + + + + + -
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
- Butylat hydroxyltoluen (BHT) được sử dụng trong nghiên cứu này có nồng độ 99%, ở dạng tinh thể màu vàng, được sản xuất bởi công ty HIMEDIA, Ấn Độ.
- 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH), metmyoglobin được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ.
- Tween 20 được mua từ công ty Loba chemie Pvt.Ltđ 107, Wondehouse Road, Mumbai 400005, Ấn Độ.
- Thiobarbituric Acid được mua từ công ty Wako Pure chemical Industries, Ltđ.
- Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCl3COOH, FeCl3, H2O2, KCl, H3PO4 được mua từ công ty Guanghua Chemical Factory Co.Ltđ.
- Các hóa chất còn lại đạt tiêu chuẩn dùng trong phân tích hóa học.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT lipid/myoglobin/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT
Trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:
MbFe(III) + H2O2 → •MbFe(IV)=O + H2O • MbFe(IV)=O + RH → MbFe(IV)=O + R• + H+ R• + O2 → ROO• ROO• + RH → ROOH + R• R• + R• → R-R R• + ROO• → ROOR
Lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy tạo thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm. Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:
→
Lipid hydroperoxide MDA
+ →
MDA TBA Phức (màu đỏ son)
Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để phân tích hoạt tính của chất chống oxy hóa.