Phương pháp này đo các chất chống oxy hóa ức chế gốc peroxyl, phản ứng của các gốc chống oxy hóa với lipid trong thực phẩm và trong hệ thống sinh lý học. Phương pháp này phát hiện các chất chống oxy hóa phân cực và kém phân cực bằng cách thay đổi dung môi.
Nguyên lý: Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxyl. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt định. Khi fluorescein bị oxy hóa , cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất chống oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là xác định được có hay không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều kiện rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.
Hình 1.12. Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 1.4.7. Phương pháp TRAP
Phương pháp này thường được sử dụng để đo khả năng chống oxy
hóa in vivo của huyết tương hoặc huyết thanh vì phương pháp này đo các chất
chống oxy hóa không phải là enzym như glutathion, acid ascorbic, tocopherol…
Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2'- azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn
là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.
1.4.8. Phương pháp FRAP
Phương pháp FRAP được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử trong huyết tương [27], [28] nhưng cũng được sử dụng để phân tích các chất chống oxy hóa trong thực vật.
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+- TPTZ[2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (butylated hydroxyl toluene). Khi cho phức Fe3+- TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ. Tác động chống oxy hóa được đánh giá bởi sự tăng cường độ màu của phức Fe (II)-TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.
1.4.9. Phương pháp FTC
Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hỗn hợp lipid của chất chống oxy hóa
Trong khảo nghiệm này, hydroperoxide sinh ra bởi acid oleic thêm vào hỗn hợp phản ứng bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ kèm trong thời gian thử nghiệm được đo gián tiếp. Sắt (II) clorua và ammonium thiocyanate phản ứng với nhau để tạo ra ferric thiocyanate (màu đỏ) nhờ hydroperoxide.
Hỗn hợp thí nghiệm gồm có: 0,1 mL mẫu chất chống oxy hóa, 1 mL acid oleic 200 mg/mL, 5 mL đệm phosphat 0,04 M; 5 mL EtOH 75%, 2 mL nước cất và giữ ở 45°C, trong bóng tối. Hỗn hợp này cũng được chuẩn bị thêm phản ứng không có acid oleic để làm đối chứng. . Sau khi mẫu có màu đỏ, độ hấp thụ được đo ngay lập tức ở bước sóng 500 nm (Trần Thị Việt Hoa et al., 2007). Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ về vạch 0.
1.4.10. Phương pháp TEAC
CationABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thụ 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối.
1.4.11. Phương pháp tổng năng lực khử
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6
thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành K3[Fe(CN)6] (xanh Pruss). Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690nm.