- Lấy một nắm cà phê sau khi lên men, rửa kỹ, cho vào lòng bàn tay bóp mạnh,
1. TIẾNG VIỆT
2.3. Định lượng hoạt độ enzyme cellulose của vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng phương pháp Bernfeld.
phương pháp Bernfeld.
Hóa chất và dụng cụ:
- Dung dịch CMC 1%, thuốc thử DNS
- Pipet, epmendoft, máy quâng phổ, bếp đun cách thủy
Cách tiến hành:
* Dựng đồ thị đường chuẩn glucose:
Từ dung dịch glucose gốc pha sẵn với nồng độ 0,5 mg/ml, tiến hành pha dãy dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50-250 µg/ml, lượng nước cần lấy để pha tính theo công thức sau: V1C1 = V2C2
Trong đó: V1: thể tích dung dịch glucose gốc ban đầu cần dùng (ml) C1: nồng độ glucose chuẩn ban dầu (0.5 mg/ml)
V2: tích dung dịch glucose có nồng độ C2 (V2=1ml) C2: nồng độ các dung dịch glucose chuẩn (µg/ml) Sau khi tính ta có bảng sau:
Nồng độ glucose C2, (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 Thể tích d2 glucose mẫu V1, (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
- Dùng pipet hút nước cất và dung dịch glucose chuẩn 0,5 mg/ml theo thể tích đã tính cho vào các eppendort để có được các dung dịch có nồng độ trên.
- Lấy 0,5 ml dung dịch glucose chuẩn bị trên của mỗi eppendort cho vào các lọ thủy tinh sạch đã có sẵn 0,5 ml thuốc thử DNS.
- Sau đó đem các lọ đi đun cách thủy ở 100oC trong khoảng thời gian 5 phút. - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
- Pha loãng dung dịch bằng 2ml nước cất, lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
- Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD 540 nm), trục hoành là nồng độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540 nm, x=[glucose](µg/ml) và hệ số tương quan R2.
* Thực hiện phản ứng thủy phân và đo OD của các mẫu
- Dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis được lấy ra ly tâm theo các khoảng thời gian nuôi cách nhau 4 giờ. Ta có 7 mẫu theo thời gian: 4 giờ, 8 giờ, 14 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, các mẫu sẽ được đem ly tâm lạnh ở 4oC và 6000 vòng/phút.
- Tiến hành làm thí nghiệm với mẫu thử không và mẫu thử thật quá trình làm như sau:
Dùng pipet hút dịch ly tâm enzyme và dung dịch CMC 1% vào các lọ thủy tinh hoặc epmendort theo bảng sau:
Mẫu (ml)
Thành phần Thử không Thử thật
Dung dịch CMC 1% 0,5 0,5
Dịch ly tâm enzyme 0 0,5
Lắc đều rồi đem ủ các mẫu thử không và thử thật ở 30oC trong 20 phút. Sau đó bổ sung 0,5 ml dịch ly tâm enzyme vào các mẫu thử không lắc đều. Hút 0,5 ml của mỗi mẫu trên cho vào các lọ thủy tinh đã đánh số giờ có sẵn 0,5 ml dung dịch DNS.
Đem đun sôi các mẫu trên khoảng 5 phút. Sau đó lấy ra và làm nguội tới nhiệt độ phòng. Pha loãng các mẫu trên bằng 2ml nước cất trộn đều và tiến hành đo OD 540nm.
Từ giá trị mật độ quang của mẫu thử thật và mẫu thử không, ta xác định được giá trị OD của mẫu tương ứng với nồng độ glucose được tạo ra trong quá trình thủy phân: ∆OD540nm = OD540nm (thử thật) - OD540nm (thử không)
Dựa vào đường chuẩn đã dựng ta xác định được nồng độ glucose giải phóng ra (µg/ml) từ quá trình thủy phân nhừ enzyme trong mẫu.
Hoạt độ enzyme được tính như sau:
.
.
x d
Hđ
v t
=
Trong đó:+ x: là lượng D –glucose được suy ra từ đường chuẩn (µg)
+ t: thời gian phản ứng (phút)
+ v: lượng enzym đã tham gia phản ứng (ml) + d: độ pha loãng của mẫu
PHỤ LỤC 3
