- Lấy một nắm cà phê sau khi lên men, rửa kỹ, cho vào lòng bàn tay bóp mạnh,
3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase
* Khảo sát hoạt tính enzyme bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân
Để thu enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis chúng tôi sử dụng môi trường có thành phần như mục 2.1.2 với chất cảm ứng là CMC. Với mục đích sử dụng vi khuẩn B. subtilis vào xử lý lớp nhớt hạt cà phê, nên chúng tôi bổ sung thêm vỏ cà phê vào môi trường với lượng thay đổi khác nhau: 2g/l (MTC1) ; 4g/l (MTC2) ; 6 g/l (MTC3), sau đó khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của B. subtilis trên các môi trường đó. Vi khuẩn B. subtilis được nuôi trên máy lắc ở 30oC, 200 vòng/phút, trong 72 giờ, sau đó tiến hành ly tâm 6000v/phút dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào vi khuẩn và thu dịch enzyme thô.
Thử hoạt tính enzyme cellulase của B. subtilis trên môi trường CMC 1% + agar 2%, trên các đĩa petri (30ml môi trường). Nhỏ dịch enzyme (20µl) vào các lỗ thạch đã đục sẵn trên đĩa thạch, để trong tủ ấm ở 30oC sau 20 giờ khuếch tán, lấy ra và nhỏ dung dịch nhuộm màu Lugol để quan sát vòng thủy phân, đo đường kính vòng thủy phân để đánh giá hoạt tính enzyme.
- Đường kính vòng thủy phân được trình bày tại bảng 3.1 và hình 3.4
Bảng 3.1. Kết quả đo đường kính vòng thủy phân enzyme cellulose của vi khuẩn B. subtilis
Ghi chú: kết quả biểu diễn trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần đo
Môi trường Đường kính vòng thủy phân enzyme cellulase (cm)
MTC1 1,55
MTC2 1,55
Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính enzyme cellulase của B. subtilis
Qua kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.3, so sánh đường kính vòng thủy phân enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis nuôi trên 3 môi trường chúng tôi thấy môi trường MTC1 và môi trường MTC2 có lượng vỏ cà phê bổ sung là 2 và 4 g/l, đường kính vòng thủy phân tương đương nhau (1,55cm) và môi trường MTC3 có lượng vỏ cà phê 1,5 g/l đường kính vòng thủy phân nhỏ nhất (1,2cm).
Sở dĩ đường kính vòng thủy phân môi trường MTC3 bé hơn vì trong vỏ cà phê hàm lượng pectin chiếm nhiều hơn so với hàm lượng cellulose, nên khi lượng vỏ cà phê trong môi trường tăng thì lượng pectin cũng tăng theo và có thể khi hàm lượng pectin quá cao sẽ làm ảnh hưởng tới khả sinh enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis. Tuy nhiên trong khoảng tăng lượng cà phê từ 2-4g/l không làm thay đổi hoạt tính enzyme. Vì vậy để tạo điều kiện cho vi khuẩn B. subtilis thích nghi với lượng vỏ cà phê cao, chúng tôi chọn môi trường MTC2 làm môi trường nuôi thu enzyme và sản xuất chế phẩm sau này.
* Khảo sát hoạt độ enzyme cellulase bằng phương pháp Bernfeld
Sau khi đánh giá hoạt tính enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân chúng tôi chọn được môi trường MTC2 để thu enzyme cellulase.
Để đánh giá hoạt độ enzyme cellulase của vi khuẩn tổng hợp có mạnh hay không và hoạt độ enzyme cellulase mạnh nhất sau bao nhiêu giờ nuôi cấy, chúng tôi
MTC1
MTC3
MTC2 MTC1
MTC3
sử dụng phương pháp Bernfeld để đo hoạt độ enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis.
Nuôi vi khuẩn B. subtilis trên môi trường MTC2 trong thời gian 84 giờ và sau mỗi 12 giờ nuôi thì chúng tôi thu mẫu dịch enzyme để xác định hoạt độ theo phương pháp Bernfeld (xem phần 2.3).
Dựa theo phương pháp Bernfeld, chúng tôi tiến hành xây dựng đồ thị đường chuẩn (hình 3.5). Đường chuẩn thu được với mức ý nghĩa là 0,05 có độ tin cậy R2 = 0,9855 > 0,98 nên có thể sử dụng để tính lượng đường trong mẫu sau khi thủy phân bằng enzyme, và từ đó xác định được hoạt độ enzyme
Dựa vào kết quả chúng tôi xây dựng đồ thị biểu diễn hoạt độ enzyme cellulase của vi khuẩn B. subtilis sinh tổng hợp theo thời gian nuôi cấy. Kết quả được thể hiện trong hình 3.5 và bảng 1.5 (phụ lục 3).
Hoạt độ enzyme (đvHc)
Hình 3.5. Đồ thị đường cong biểu thị hoạt tính enzyme cellulase thủy phân cơ chất CMC của vi khuẩn B. subtilis theo thời gian nuôi cấy
Qua đồ thị trên ta thấy lượng enzyme cellulase trong môi trường nuôi ở 12 giờ đầu hầu như không có, vì thành phần dinh dưỡng của môi trường lúc này còn nhiều nên vi khuẩn sử dụng lượng dinh dưỡng này mà không tổng hợp ra enzyme để phân hủy các cơ chất phức tạp khác. Sau 24 giờ lượng enzyme cellulase trong môi trường đạt 100(đvHc) như vậy trong khoảng từ 12 đến 24 giờ tốc độ sinh enzyme rất mạnh. Từ 24-72 giờ lượng enzyme tổng hợp ra môi trường tiếp tục tăng, lượng enzyme tạo ra đạt cao nhất ở 72 giờ là 281(đvHc). Vì vậy chúng tôi chọn thời gian 72 giờ nuôi vi khuẩn B. subtilis để thu enzyme cellulase. Với kết quả trên chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis với thể tích lớn trên môi trường MTC2 sau 72 giờ thì ngừng và đem sử dụng, phối trộn với các chủng khác để xử lý lớp nhớt cà phê.