3.5.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với dung dịch chloroform. Chloroform có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Sau khi ly tâm, hỗn hợp được phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là chloroform. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới.
Tiếp theo là bước thu tủa bằng cách bổ sung một lượng dung dịch tủa (precipition solution) đã pha sẵn. Dung dịch này có tác dụng làm kết tủa DNA. Ly tâm thu tủa và bổ
sung 100l NaCl 1,2M và 1 ml EtOH 100 %. EtOH có tác dụng hút lớp nước bao quanh
phân tử DNA, để lộ các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với
các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị
kết tủa. Trong điều kiện -200C, thời gian 15 phút thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn.
Tủa thu được được rửa bằng EtOH 70 %, làm khô trong máy Speed Vac, hoà tan trong nước khử ion vô trùng sau đó đem điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 %.
Kết quả điện di cho thấy, cả 2 băng DNA tổng số của mẫu gà Hồ (số 2), gà Mía (số 4) đều sáng tập trung và tương đối rõ nét, cho thấy nồng độ của DNA thu được tương đối cao và ít bị phân huỷ. Vị trí của giếng tra mẫu không còn vệt sáng trắng chứng tỏ protein đã được loại hầu như hoàn toàn ra khỏi dung dịch DNA tổng số. Như vậy có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.7: Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8 % Vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía.
3.5.2. Xác định trình tự gen mã hoá cytocchrome b ở các mẫu gà
3.5.2.1.Nhân vùng trình tự gen mã hóa cytochrome b ty thể ở gà
Gen cytochrome b được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Kích thước gen 1143 bp nên chúng tôi
thiết kế cặp mồi GCYTB_NF và GCYTB_NR để nhân đoạn trình tự 1,2 kb có chứa
gen Cyt b. Các thông tin về cặp mồi này như sau:
GCYTB_NF: GCC TTG CCA ACC TTC ATC TC (Tm = 60,60C)
GCYTB_NR: GGG GTG TTC TAC TGG TTG GCT TCC (Tm = 66,60C)
Sử dụng cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước khoảng 1,2 kb. Thành phần và chương trình chạy PCR của chúng tôi đã nêu ở phần phương pháp. Việc thiết kế chương trình chạy PCR tuỳ thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và Tm của các mồi sử dụng. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính sau:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Hỗn hợp phản ứng được đưa lên 94 - 950C
trong thời gian 30 giây đến 1 phút để làm biến tính DNA khuôn. Ở đây chúng tôi đặt
chương trình là 940C trong 1 phút để đảm bảo toàn bộ DNA đã biến tính hoàn toàn.
- Giai đoạn gắn mồi (annealing): Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi,
cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Chúng tôi đặt chương trình là 530C thấp hơn Tm của
cả 2 mồi và kéo dài 1 phút.
- Giai đoạn tổng hợp (extension): Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho Taq
polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian cho giai đoạn này là 1 phút 20 giây.
Trước giai đoạn đầu tiên, chúng tôi đặt 940C trong 4 phút để biến tính hoàn toàn DNA trong mẫu. Sau giai đoạn cuối cùng của chu kỳ cuối chúng tôi đặt chương trình
720C trong 10 phút để đảm bảo các phân tử DNA được tổng hợp hoàn toàn. Chương
trình PCR được đặt với tổng số chu kỳ là 35.
Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8 %. Kết quả thể hiện trên hình 3.8.
Như vậy, kết quả cho thấy cả 2 giống gà chúng tôi tiến hành đều thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Trên điện di đồ kích thước DNA của sản phẩm PCR vào khoảng 1,2 kb là phù hợp với tính toán lý thuyết. Cả hai băng DNA của gà Hồ và gà Mía thu được đều đậm và sáng, đạt yêu cầu để tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn và giải trình tự trực tiếp.
Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8 % M: Thang DNA marker 1 kb; vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía 3.5.2.2. Xác định đa hình gen mã hóa Cytochrome b bằng enzyme giới hạn
Để kiểm tra sự đa hình trong trình tự nucleotide của gen cytochrome b trên hai giống gà nghiên cứu chúng tôi dùng một số enzyme giới hạn để có thể nhận biết sơ bộ sự khác nhau giữa chúng.
a. Phản ứng cắt bằng HincII
Theo lý thuyết enzyme HincII có 1 điểm cắt tại vị trí nucleotide 514 trên gen Cyt b nên chúng tôi dự kiến kết quả cắt bằng enzyme này sẽ tạo ra 2 băng có kích thước 520 và
680 bp. Thành phần của phản ứng cắt gồm 15l sản phẩm PCR, 1,5 l đệm Tango (10x),
6,5l nước và 1l enzyme. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 370C, qua đêm.
Hình 3.9: Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng HincII trên gel agarose 1,5% M: Thang DNA Marker 100 bp; Vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía.
Kết quả trên hình phía trên cho thấy tất cả mẫu gà đều có chung một điểm cắt
duy nhất của enzyme HincII, hai băng thu được có kích thước khoảng 520 bp và 680 bp
phù hợp với tính toán lý thuyết. Điều này cũng chứng tỏ rằng, không có sự đa hình trình
tự nucleotide ở vị trí nhận biết của enzyme HincII trên gen Cyt b ở 2 mẫu gà thuộc 2
giống nghiên cứu.
b. Phản ứng cắt bằng enzyme HhaI
Theo lý thuyết enzyme HhaI có 1 điểm cắt trên gen Cyt b tại vị trí nucleotide
263 nên chúng tôi dự kiến kết quả cắt bằng enzyme này sẽ tạo ra 2 băng có kích thước
400 và 800 bp. Thành phần của phản ứng cắt gồm 15 l sản phẩm PCR, 1,5 l đệm
Tango (10x), 6,5l nước và 1 l enzyme. ủ hỗn hợp phản ứng ở 370C, qua đêm.
Hình 3.10: Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng HhaI trên gel agarose 1,5%. M: Thang DNA Marker 100 bp; Vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía
Kết quả trên hình trên cho thấy cả 2 giống gà đều có chung 1 điểm cắt của
enzyme HhaI, kích thước 2 đoạn thu được là 400 và 800 bp, phù hợp với tính toán lý
thuyết, không thấy xuất hiện sự đa hình trong trình tự nhận biết của enzyme này trên các mẫu nghiên cứu.
c. Phản ứng cắt bằng enzyme NcoI
Thành phần của phản ứng cắt bằng enzyme NcoI gồm 15 l sản phẩm PCR, 1,5 l đệm số 4 (10x), 7,3 l nước và 1,2 l enzyme NcoI (Biolabs). Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 370C, qua đêm.
Theo lý thuyết NcoI có một điểm cắt trên gen Cyt b, kết quả thu được 2 băng có
Hình 3.11: Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng NcoI trên gel agarose 1,5% M: Thang DNA Marker 100 bp; Vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía
Hai băng thu được có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Kết quả cho thấy không có sự đa hình trong trình tự nhận biết của enzyme NcoI trên hai mẫu gà nghiên cứu.
d. Phản ứng cắt bằng enzyme SaII
Thành phần của phản ứng cắt bằng enzyme SaII gồm 15 l sản phẩm PCR, 1,5 l đệm số 0 (10x), 7,3l nước và 1,2 l enzyme SaII. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 370C, qua đêm.
Theo lý thuyết SaII có một điểm cắt trên gen Cyt b, kết quả thu được 2 băng có
kích thước khoảng 530 bp và 670 bp.
Hình 3.12: Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng SaII trên gel agarose 1,5% M: Thang DNA Marker 100 bp; Vị trí số 2: gà Hồ; vị trí số 4: gà Mía
Kết quả trên hình trên cho thấy cả 2 giống gà đều có chung 1 điểm cắt của
enzyme SaII, kích thước 2 đoạn thu được là 530 và 670 bp, phù hợp với tính toán lý
thuyết, không thấy xuất hiện sự đa hình trong trình tự nhận biết của enzyme này trên các mẫu nghiên cứu.
Như vậy, theo kết quả điện di thu được, tất cả các mẫu gà nghiên cứu đều có chung điểm cắt đối với các enzyme HincII, HhaI, NcoI và SaII, từ đó có thể kết luận chúng không có sự khác biệt đa hình nào trong trình tự nhận biết của các enzyme này. Như vậy, tại các điểm cắt của các enzyme không có sự khác nhau về trình tự nucleotide của hai gen mã hóa cytochrome b ty thể của hai mẫu gà nghiên cứu hay nói cách khác hai gen mã hóa cytochrome b ty thể của hai mẫu gà nghiên cứu có sự đồng nhất cao vể trình tự nucleotide.
3.5.2.3. Phân tích trình tự gen mã hóa cytochrome b ty thể ở các mẫu gà
Chúng tôi tiến hành xác định trình tự gen cytochrome b của các mẫu gà nghiên cứu theo phương pháp đọc trực tiếp từ sản phẩm PCR. Trình tự được xác định tự động trên máy ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sử dụng phần
mềm SeqScape để kết hợp số liệu của 2 chiều đọc, chúng tôi đã thu được trình tự 976
bp của gen cytochrome b của các mẫu gà nghiên cứu.
Sau đó, các trình tự này được so sánh với trình tự cytochrome b của gà Gallus
gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật Bản mang mã số NC_001323 trên ngân hàng gen Quốc tế (Genbank). Kết quả được thể hiện ở hình dưới.
14893 NC_001323 ATGGCACCCA ACATTCGAAA ATCCCACCCCCTACTAAAAA TAATTAACAA 14942 HO ... ... ……….... ………... ………. MI ... ... ...………... ………... ………. NC_001323 CTCCCTAATC GACCTCCCAG CCCCATCCAACATCTCTGCT TGATGAAATT 14992 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 TCGGCTCCCTATTAGCAGTCTGCCTCATGACCCAAATCCTCACCGGCCTA 15042 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 CTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCT TCTCCTCCGT 15092 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 AGCCCACACT TGCCGGAACG TACAATACGG CTGACTCATCCGGAATCTCC 15142 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 ACGCAAACGG CGCCTCATTCTTCTTCATCT GTATCTTCCT TCACATCGGA 15192 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ……….
NC_001323 CGAGGCCTATACTACGGCTCCTACCTCTACAAGGAAACCT GAAACACAGG 15242
HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ……….
NC_001323 AGTAATCCTC CTCCTCACACTCATAGCCACCGCCTTTGTG GGCTATGTTC 15292 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 TCCCATGGGG CCAAATATCATTCTGAGGGG CCACCGTTATCACAAACCTA 15342 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 TTCTCAGCAATTCCCTACAT TGGACACACCCTAGTAGAGT GAGCCTGAGG 15392 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. 15399 15434 NC_001323 GGGATTTTCA GTCGACAACCCAACCCTTACCCGATTCTTC GCTTTACACT 15442 HO ... ... ... ... …. .C………... MI ...C…... ... ... ... ….C... NC_001323 TCCTCCTCCC CTTTGCAATC GCAGGTATTACTATCATCCACCTCACCTTC 15492 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 CTACACGAATCAGGCTCAAA CAACCCCCTA GGCATCTCATCCGACTCTGA 15542 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 CAAAATTCCATTTCACCCATACTACTCCTTCAAAGACATTCTGGGCTTAA 15592 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 CTCTCATACTCACCCCATTC CTAACACTAG CCCTATTCTCCCCCAACCTC 15642 HO ... ... ………... ………... ………. MI ... ... ………... ………... ………. NC_001323 CTAGGAGACC CAGAAAACTTCACCCCAGCA AACCCACTAG TAACCCCCCC15692 HO ... ... ………... ……….…... ………. MI ... ... ……….... ……….………... ………. NC_001323 ACATATCAAACCAGAATGATATTTTCTATTCGCCTATGCCATCCTACGCT 15742 HO ... ... ………... …………..…... …………...……. MI ... ... ………... …………..…... …………...……. NC_001323 CCATCCCCAACAAACTTGGA GGTGTACTAG CCCTAGCAGC CTCAGTCCTC 15792 HO ... ... ………... …………..…... …………...……. MI ... ... ………... …………..…... …………...……. NC_001323 ATCCTCTTCC TAATCCCCTTCCTCCACAAATCTAAACAAC GAACAATAAC 15842 HO ... ... ………... …………..…... …………...……. MI ... ... ………... …………..…... …………...……. NC_001323 CTTCCGACCACTCTCCCAAACCCTAT15868 HO ... ... ... MI ... ... ...
Theo kết quả đọc trình tự đoạn 976 bp chúng tôi thấy các mẫu gà nghiên cứu có một số điểm đa hình so với trình tự Cyt b tương ứng của gà mang mã số NC_001323. Khác biệt nhiều nhất là ở mẫu gà Mía có 2 điểm đa hình, tương ứng có sự thay đổi nucleotide ở 2 vị trí so với trình tự của gà NC_001323. Mẫu gà Hồ chỉ có 1 điểm đa hình, tương ứng có sự thay đổi nucleotide ở 2 vị trí so với trình tự của gà NC_001323. Qua hình 3.13 cũng cho thấy, gà Hồ có 1 vị trí thay thế nucleotide và vị trí thay thế nucleotide này cũng trùng với vị trí thay thế nucleotide của gà Mía. Qua đó cho thấy, có sự đồng nhất đáng kể về trình tự nucleotide của gen mã hóa cyt b của hai giống gà nghiên cứu hay nói cách khác sự đồng nhất đáng kể về mặt di truyền giữa hai giống gà nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Đàn gà Hồ chiếm tỷ lệ 9,14 - 15,46 % so với tổng đàn gà được điều tra tùy thuộc vào từng thôn, tập trung chủ yếu ở những người trong hội gà Hồ và những người có tâm huyết, thú chơi gà. Gà Hồ có tầm vóc tương đối lớn, thiên về hướng thịt ở giai đoạn trên 6 tháng tuổi. Đối với gà điều tra gà Hồ có chiều dài thân là 20,79 cm, dài cánh là 22,65 cm, dài đùi là 15,18 cm, dài lườn là 13,16 cm và vòng ngực là 29,44 cm; đối với gà khảo nghiệm, chiều dài thân là 22,26 cm, dài cánh là 24,38 cm; dài đùi là 16,35 cm; dài lườn là 14,39 cm và vòng ngực là 30,86 cm. Gà Hồ có màu lông không đồng nhất, gà trống có màu mận chín và màu đen, trong đó màu mận chín chiếm tỷ lệ là 55,67 % (kết quả điều tra) đến 63,16 % (kết quả nuôi khảo sát), còn lại là màu đen. Gà mái Hồ có màu lông rất đa dạng bao gồm: màu mã thó, mã nhãn và mã xẻ. Tỷ lệ màu mã thó ở gà mái là 51,52 - 56%, màu mã nhãn chiếm tỷ lệ là 38 - 42,42 %, màu mã xẻ chiếm tỷ lệ 6 - 6,06 %. Gà Hồ có tỷ lệ nuôi sống ở 12 tuần tuổi là 87,30 % (số liệu điều tra); 90 % (số liệu nuôi khảo sát). Ở 20 tuần tuổi, tỷ lệ nuôi sống của gà Hồ là: 82,54 - 88,33 %. Ở 12 tuần tuổi, khối lượng của gà điều tra đạt 1149,82 g/con thấp hơn so với gà nuôi khảo sát (đạt 1290,09 g/con). Khối lượng của gà Hồ tại thời điểm 20 tuần tuổi là: Đối với gà điều tra con trống là 2123,68 g/con, con mái là 1713,33 g/con; gà nuôi khảo sát con trống đạt 2285,56 g/con, con mái đạt 1786,57 g/con. Tiêu tốn thức ăn cộng dồn/kg tăng khối lượng của gà nuôi khảo sát tại thời điểm 20 tuần tuổi là 3,45 kg.
- Đàn gà Mía chiếm tỷ lệ 51,6 - 66,62 % so với tổng đàn gà được điều tra, tùy thuộc và từng thôn. Tuy nhiên gà Mía đã phát triển mạnh, người dân đã nuôi với quy mô lớn, với mục đích kinh tế. Gà Mía có tầm vóc tương đối lớn, cũng thiên về hướng thịt. Đối với gà điều tra, dài thân là 19,56 cm; dài cánh là 20,71 cm; dài đùi là 15,28 cm; dài lườn là 11,59 cm và vòng ngực là 28,23 cm; đối với gà nuôi khảo sát, dài thân là 20,43 cm; dài cánh là 21,82cm; dài đùi là 15,98 cm; dài lườn là 12,7 cm và vòng ngực là 29,46 cm. Gà Mía cũng có màu lông không đồng nhất, ở con trống có màu mận chín chiếm tỷ lệ 61,82 - 66,67 %, còn lại là màu đen; ở con mái chủ đạo là màu lá chuối khô - xám chiếm tỷ lệ 72,06 – 77,14 %, còn lại là một số màu pha tạp khác. Gà Mía có tỷ lệ nuôi sống ở 12 tuần tuổi là 87,14 % (kết quả điều tra) và 88,33 % (kết quả nuôi khảo sát). Ở 20 tuần tuổi, tỷ lệ nuôi sống với gà điều tra là 81,43 %, với gà nuôi khảo sát là 85 %. Tại thời điểm 12 tuần tuổi, gà Mía điều tra có khối lượng con trống là 1250,60 g/con, con mái là 1108,75 g/con;